荧光定量PCR使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。在PCR扩增过程中，会加入一对引物和一个特异性的荧光探针。探针通常是一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性会将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就会有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。