将第二代菌种管冷冻保存，而工作用菌种则需在适当温度下培养一段时间，以便用于后续试验。取一支冷冻保存的G2代菌种转种到平板和斜面上，平板上的菌种制成冷冻保藏管，这被标记为第三代（G3），而斜面上的菌种则继续用作工作用菌种（W3）。将第三代菌种冷冻保存，同时对G2菌种进行灭菌处理后丢弃。当工作用菌种代数小于5时，可以直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。例如，W3可以直接转接到W4。按照上述方法操作，直到G4转为W5，此时需要重新开启安瓿，再次重复上述操作程序、保藏和使用菌种。