在转录过程中，RNA聚合酶只能在RNA的3′端连接新的核苷酸，因此，mRNA分子是按5′端到3′端方向延长的。该酶需要四种核糖核苷酸三磷酸（NTP：ATP、GTP、CTP、UTP）作为RNA聚合酶的底物，DNA为模板，二价金属离子Mg2+、Mn2+是该酶的必需辅因子，其催化的反应表示为：（NMP）n+NTP→（NMP）n+1+PPi，RNA链的合成方向也是5→3，第一个核苷酸带有3个磷酸基。其后每加入一个核苷酸脱去一个焦磷酸，形成磷酸二酯键，焦磷酸迅速水解的能量驱动聚合反应，与DNA聚合酶不同，RNA聚合酶无须引物，它能直接在模板上合成RNA链；RNA聚合酶能够局部解开DNA的两条链，所以转录时无须将DNA双链完全解开，RNA聚合酶无校对功能。