注意什么 培养基消毒基本方法

培养基消毒基本方法 注意什么

食用菌常用消毒药剂主要有甲醛、高锰酸钾、硫黄、酒精、漂白粉、石炭酸、来苏尔、新洁尔灭、多菌灵等。甲醛又称，高锰酸钾为具有金属光泽的暗紫色棱状晶体，是强氧化剂，二者配合使用进行菇房熏蒸；硫黄，主要用于培养室熏蒸，有杀菌、杀虫、杀螨作用；酒精学名为乙醇，70%～75%浓度主要用于分离菌种或接种时皮肤表面消毒；漂白粉也叫含氯石灰，为白色粉末，3%浓度用于地面、空间和水消毒；石炭酸化学名为苯酚，3%～5%水溶液用于培养室或器械工具消毒；来苏尔也叫煤酚皂液，3%～5%水溶液用于培养室或工具消毒；新洁尔灭也叫季铵盐，5%水溶液用于皮肤、器械和培养室消毒；多菌灵有50%和25%可湿性粉剂两种剂型，目前市场上又出现了80%可湿性粉剂，主要用于培养料拌料和培养室消毒，主要抑制真菌生长。以下介绍几种常见消毒方法和消毒剂。

（1）空间消毒

接种室和接种箱是接种操作的场所，必须保持高度无菌，这需要使用前的消毒处理和日常卫生的保持。常用的消毒方法有药物熏蒸、药液喷雾和紫外线灯照射三种。三种并用时，效果最好。

药物熏蒸消毒：接种室和接种箱都可使用。当用药物熏蒸接种室时，必须在使用前一天进行。熏蒸用药物和用量为甲醛7～8mL+高锰酸钾5g/m3。处理时，先关闭门窗，将称好的高锰酸钾放在大烧杯或盆内，然后屏住呼吸倒入甲醛，立即出室关门。高锰酸钾使甲醛迅速气化。甲醛对人的眼睛和呼吸道有强烈的刺激作用，因此，熏蒸12h后必须用和甲醛量相等的氨水中和空气中的甲醛，以便接种操作。摆放氨水杯要在接种操作前3～5h进行。也可使用气雾消毒剂进行空气消毒，使用方法参考产品使用说明书。

当接种室内使用接种箱进行接种操作时，接种室不需每次接种前都进行熏蒸消毒处理，这种熏蒸只作为定期处理即可，生产旺季一般每周处理一次，其他季节每月处理一次。

药液喷雾消毒：接种操作开始前，用5%石炭酸液或煤酚皂化液（来苏尔）喷雾。这些消毒液除具杀菌作用外，还可降沉空气中的尘埃和杂菌孢子，净化空气，减少接种操作中的污染。

紫外线灯照射消毒：紫外线消毒是利用紫外线灯照射，使细菌发生直接光化学反应，将细菌细胞质诱导形成胸腺嘧啶双聚体，从而抑制DNA的复制而致死；另外，空气在紫外线的照射下，一部分氧原子（O2）电离成原子氧（O），再将一部分氧氧化成臭氧（O3），或将水（H2O）氧化成过氧化氢（H2O2），原子氧、臭氧和过氧化氢均具有一定的杀菌作用，使空气中的细菌死亡。

接种操作前，打开紫外线灯消毒30min，如果使用普通紫外线灯，关闭后必须隔40min，待臭氧散尽后才可入室工作。如果使用无臭氧紫外线灯，关闭后可立即入室操作。紫外线灯管使用超过2～500h后，作用强度明显下降，要定期更换，一般每使用4～000h后更换。

（2）器具消毒

酒精：为无色透明液体。易挥发、易燃，沸点78.5℃，市场销售的多为医用酒精，浓度95%，与水能以任何比例混合，性质稳定，无腐蚀作用。常用作皮肤、器皿和分离材料表面消毒。对细菌营养体、真菌营养体、孢子及病毒有杀伤作用，对细胞芽孢无效。只用作表面消毒剂，常用浓度为75%的水溶液，为了降低成本，也可用工业酒精代替。

高锰酸钾：为具有金属光泽的暗紫色棱状晶体，是强氧化剂，能溶于水，呈紫红色，红色水溶液在酸或碱性条件下都不稳定，易分解失效。具强烈腐蚀性，能氧化菌体蛋白，导致菌体死亡。0.1%浓度水溶液作用10～30min，可杀灭细菌营养体。2%～5%水溶液作用24h，可杀灭细菌芽孢。在常用0.1%浓度下接触对人体无害。常用0.1%～0.2%水溶液浸泡工具、塑料薄膜等包盖物，水溶液暴露在空气中易分解，所以要现配现用。操作时勿用湿手接触药品，以免手指被腐蚀。

煮沸消毒：沸水中煮沸15～20min。要杀死芽孢可煮沸1～2h或于水中添加0.5%石碳酸或碳酸钠。这种方法适用于器材等小型日用品的消毒。此法在一般煮锅中即可进行。

（3）培养料消毒

多菌灵：又名苯丙咪唑44号，化学名N-（2-苯丙咪唑基）甲酸甲酯。工业品为棕红色粉末，不溶于水，可溶于有机酸，化学性质稳定，300℃以上分解，遇碱性物质易分解失效，为高效、低毒、广谱性内吸性杀菌剂，对人畜低毒，残效长，剂型有25%、50%可湿性粉剂，40%胶悬剂，目前市场上又出现了80%可湿性粉剂。多菌灵是食用菌生产上常用的药剂，多菌灵对食用菌防治是否适用，主要取决于食用菌菌丝对多菌灵的敏感度，一般划分为三种类型：不敏感型（如香菇、金针菇等），在0.001%、0.01%、0.05%和0.1%的浓度下，菌丝均能正常生长；微敏感型（如糙皮侧耳、紫孢侧耳、凤尾菇、榆黄蘑等），在上述4种浓度中，以0.01%最敏感，菌丝完全不生长或生长极慢，在其他3种浓度下菌丝仍可生长；极敏感型（如猴头、木耳、银耳等），在0.001%～0.1%浓度范围内，菌丝生长受到抑制。对青霉、木霉、蘑菇粉孢霉及疣孢霉、褐斑病等子囊菌和半知菌中大部病原菌和竞争性杂菌有良好的防治效果，对细菌的病害无效。床面或覆土表面用25%可湿性粉剂的500～1000倍液喷施，拌料用500～1000倍液，常用浓度为800倍液。多菌灵可与其他杀菌剂混合使用，与杀虫剂、杀螨剂混合要随配随用，不能与铜制剂混用。

克霉灵：用氯、磷、硫等成分化学合成，具有较强干扰性，高度的选择性，可干扰食用菌生产中常见杂菌（如绿色木霉、链孢霉）细胞的正常生理活动，而不影响食用菌菌丝的正常生长，具有高效、广谱、低残留的特点，对绿色木霉有独特的防治效果。克霉灵有两种剂型：Ⅰ型和　Ⅱ型，均能用于生料拌料和霉菌污染的防治。平菇用0.2%～0.25%浓度；香菇、真姬菇用0.3%～0.4%浓度；黑木耳用0.2%～0.3%浓度；猴头、金针菇用0.25%～0.3%浓度，每间隔1d连喷2～3次，局部污染严重时用1%浓度注射封闭，杀灭效果可达100%。对毛霉、青霉等霉菌以及酵母菌也有较强杀菌作用。

石灰拌料：石灰有生石灰和熟石灰之分，生石灰是以碳酸钙成分为主的石灰石或贝壳等天然原料经800～1～000℃煅烧所得的产品，呈块状结构，又叫氧化钙。生石灰吸水后则成为熟石灰，呈粉状结构，又叫氢氧化钙。熟石灰吸收二氧化碳后，一部分则转变成轻质碳酸钙，均为碱性物质。在培养料中加入石灰能起到调节酸碱度、增加碱性的作用。一般1%～3%石灰水就可起很好的杀菌作用，起杀菌作用的是熟石灰中的氢氧根离子，能水解蛋白质和核酸，使微生物的酶系和结构受到损害，并能分解菌体中的糖类。如用0.5%石灰水浸泡稻草2h或更长时间，也可起到杀菌与软化纤维的作用。菌筒或菌砖上发现霉菌污染时，也可将生石灰直接撒到污染菌面上，杀菌效果良好。

发酵杀菌：在食用菌生产中经常采用培养料堆制发酵的方法，由微生物的代谢热所产生的高温，使培养料发酵腐熟的同时，杀死培养料中杂菌的营养体、害虫的幼虫及卵。

拌药消毒：在食用菌生料栽培的过程中，对培养料进行拌料时，通常要加入0.1%多菌灵粉或0.1%甲基托布津等杀菌剂，以杀死杂菌或抑制杂菌的生长。在堆制培养料时，常常加入1%～2%的生石灰，这不仅有消毒灭菌的作用，同时还可以调节培养料的pH。

（4）分离料消毒

升汞：也叫氯化汞，剧毒，对金属有腐蚀性，易被皮肤和黏膜吸收。使用浓度为0.1%，配制方法是取1g升汞，溶于25mL浓盐酸中，然后再加水1000mL。主要用于分离子实体表面杀菌和接种箱、培养箱涂抹消毒。

乙醇：常用浓度为75%的酒精，用于分离材料表面消毒。如将95%的酒精配制成某个浓度（%）酒精的方法如下：如需配制成75%的酒精，则取95%的酒精75mL，盛在量筒内，加水达95mL，即为75%的酒精。

3）消毒效果检查

接种室（箱）在每次接种前均要采用化学方法进行消毒灭菌，灭菌效果受药剂有效期及操作等因素影响很不稳定，因此应定期对消毒灭菌效果和空气污染程度进行检验，以便更换失效药剂，改进消毒措施和操作方法。常用检验方法有平板法和斜面法两种。

（1）平板法　一般采用培养微生物主要类群的常规法，配制肉汤琼脂培养基和马铃薯葡萄糖培养基，按无菌操作规程分别将培养基倒入培养皿中制成平板，每种培养基各取6个，同时放入接种室（箱）内。检验时，按无菌操作法各打开3个皿盖，暴露一定时间后再重新盖上；另3个不打开皿盖作对照。然后将两组一起置于30℃温度下进行培养，48h后取出观察。根据有无菌落、菌落个数和形态来判断接种室（箱）被污染程度和杂菌种类。

（2）斜面法　取常规制作的肉汤琼脂培养基和马铃薯葡萄糖培养基斜面试管各6支，放入接种室（箱）内，按无菌操作法各打开其中3支试管棉塞（拔下的棉塞置于无菌培养皿中），暴露一定时间后，再重新塞上棉塞，另3支不打开棉塞作对照，然后将两组一起置于30℃温度下培养，48h后取出观察。根据有无菌落、菌落个数和形态来判断接种室（箱）被污染程度和杂菌种类。

合格标准：平皿打开盖5min不超过3个菌落；斜面打开棉塞30min不长菌落。若生长菌落超过此数字，则要采取措施提高灭菌效果。如果是用紫外线灯照射达不到灭菌要求，则可调整紫外线灯照射时间或悬挂高度，或更换新灯管。从菌落形态看，如果是霉菌占多数，先用5%石炭酸对接种室（箱）进行全面喷雾，再用熏蒸；如果是细菌占多数，采用乳酸和交替熏蒸法效果好。

4）影响消毒剂效果的因素

影响消毒剂效果的因素主要有环境条件、杂菌种类和数量、药剂作用时间和剂量、培养基成分4方面。

（1）环境条件　主要指温度和湿度。温度高效果好，如苯酚、来苏尔加热至40℃以上杀菌作用明显增强；湿度越大，杀菌效果也越好，如硫黄熏蒸消毒时，空间和用具物品用水喷湿，比干燥时效果显著提高。

（2）杂菌种类和数量　不同杂菌对各种消毒剂有不同的敏感度，一般中温型类群的杂菌，杀菌温度要高于低温型类群，而低于高温型类群。孢子、芽孢对高温、干燥及化学药剂抵抗力要高于营养体细胞。培养基中杂菌数量多，应延长杀菌时间和增加剂量。

（3）药剂作用时间和剂量　根据具体杀菌对象和培养基中杂菌数量而定，一般药剂作用时间越长，效果越好，在致死剂量范围内，剂量增加，杀菌时间可适当减少，反之则需延长时间。

（4）培养基成分　培养基中加入某些有机质，如肉汤、干酵母粉等，苯酚杀菌力将下降30%；细菌菌悬液中加糖和蛋白质等营养物质，对它将产生不同程度的保护作用，减弱杀菌效果。

总之，任何一种消毒剂不可能对各类杂菌都有杀菌能力，因此需要几种消毒剂联合使用，交替使用或配合使用，可以起到增效作用，提高杀菌力，减少杂菌的抗药或耐药性，缩短杀菌时间和维持药效稳定。消毒药剂配制时称量应精确，不用盐类、有机物及杂质硬水，要求现配现用。