菌种生产的消毒灭菌方法

菌种生产的消毒灭菌方法 需要准备什么

一、任务目的

·能够掌握空间、用具消毒和灭菌的技术。

·熟练操作紫外线和干、湿热灭菌技术。

二、材料与仪器

包扎的培养皿、试管、移液管等、溶液或试剂3%～5%石炭酸或2%～3%来苏尔溶液。电热鼓风干燥箱、手提式高压蒸汽灭菌锅、紫外线灯等。

三、任务原理

在食用菌菌种制作或栽培过程中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。消毒是通过物理或化学方法杀死或除去部分微生物，但不能杀死细菌芽孢，如子实体组织分离时，表面用消毒酒精处理杀死杂菌营养体。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧灭菌、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。

四、任务实施

1.干热灭菌

（1）玻璃器皿的洗涤和包扎

①玻璃器皿的洗涤：玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。

②灭菌前玻璃器皿的包装：培养皿的包扎可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。

移液管的包扎：在移液管的上端塞入少许普通棉花，它的作用是避免外界杂菌进入管内。

先将报纸裁成宽5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45°角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，用手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

（2）干热灭菌

①装入待灭菌物品　将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门。堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。

②升温　接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋转恒温调节器，使温度逐步上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的140～160℃，则需要转动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。

③恒温　当温度升到140～160℃时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。干热灭菌过程中，严防恒温调节器自动控制失灵而造成安全事故。

④降温　切断电源，自然降温。

⑤开箱取物　待电热干燥箱内温度降到60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时，应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到60℃以下，切勿打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂或因热空气灼伤操作者。

（3）实验报告

结果：检查灭菌是否彻底。

讨论：依据实验原理、灭菌时间、灭菌物品等进行讨论。

（4）思考与作业

在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？

2.高压蒸汽灭菌

（1）操作方法

①将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面高出三角搁架1cm为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

②放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

③加盖，先将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

④加热，同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

⑤到灭菌所需时间后，关闭电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

⑥将取出的灭菌培养基摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

（2）实验报告

结果分析：检查培养基灭菌是否彻底。

问题讨论：为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。

（3）思考与作业

①高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

②在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？

③灭菌在食用菌实验操作中有何重要意义？

3.紫外线灭菌

紫外线灭菌操作步骤如下。

①单用紫外线照射　在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃温箱培养24h，共做三套。检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过2个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。

②化学消毒剂与紫外线照射结合使用　在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。检查灭菌效果方法同“单用紫外线照射”。

③使用紫外线进行消毒灭菌的注意事项　由于紫外线穿透能力较弱，不能透过玻璃或纸张等，因此只适合于空气以及物体表面的消毒。因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直接在紫外线灯光下工作。