20200508 RNF180、Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)(CSZ190

产品中文名称：RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒

（PCR荧光探针法）

产品管理类别：第三类 6840

申请人名称：博尔诚（北京）科技有限公司

国家药品监督管理局

医疗器械技术审评中心目录

基本信息 (3)

一、申请人名称 (3)

二、申请人住所 (3)

三、生产地址 (3)

产品审评摘要 (4)

一、产品概述 (4)

二、临床前研究摘要 (5)

三、临床评价摘要 (13)

四、风险分析及说明书提示 (19)

综合评价意见 (23)基本信息

一、申请人名称

博尔诚（北京）科技有限公司

二、申请人住所

北京市北京经济技术开发区宏达南路18号院3号楼10层

三、生产地址

北京市北京经济技术开发区宏达南路18号院4号楼3层、2号楼501-504室、1幢-1层-101 A区和B区产品审评摘要

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

产品主要组成成分见下表

（二）产品预期用途

该产品用于体外定性检测人血浆中甲基化的RNF180及Septin9基因。

该产品适用于经临床医师诊断建议胃镜检查同时由于患者个人原因拒绝进行胃镜检查的患者。检测结果阳性不作为胃癌早期诊断或确诊的证据，检测结果阴性也不能排除胃癌的可能，患者最终诊断应依据胃镜检查结果。该产品不用于普通人群的肿瘤筛查。基于现有研究，仅限于有胃癌家族史者或40岁以上胃癌高风险人群检测。

（三）产品包装规格

30人份/盒

（四）产品检验原理

RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）包括两个步骤。步骤1，使用血浆游离DNA提取试剂盒提取血浆中的游离DNA，然后用亚硫酸盐转化未发生甲基化的胞嘧啶，通过脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐，发生甲基化的胞嘧啶则不会被亚硫酸盐转化；步骤2，甲基化的DNA做三重PCR扩增，PCR 反应中的阻断剂和探针能区分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列得到扩增，与甲基化RNF180基因和Septin9基因序列特异性结合的荧光素探针可以在PCR反应中专一地检测出甲基化序列。内对照ACTB（ß-actin）基因用于评估检测中DNA量是否足够。试剂盒中提供了阳性和阴性对照，两者在每一次检测中都需要同时加入。

二、临床前研究摘要

（一）主要原材料

1.主要原材料的选择

本产品的主要原材料包括引物、探针、阻断剂、DNA聚合酶、dNTPs、细胞株DNA和WBC DNA。这些原料均是通过外购的方式获得。

其中引物、探针及阻断剂的序列均由申请人自行设计，由合成公司经过合成、修饰、纯化方式获得；DNA聚合酶、dNTPs 由供应商化学合成获得；细胞株DNA和WBC DNA由生产商经过接种、传代、收集和细胞系DNA的提取纯化获得。

申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

2.企业参考品设置情况

本产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品以及检测限参考品。

企业参考品的主要原料为TE稀释液与细胞系DNA，包括RNF180基因相应位点甲基化的细胞系DNA，Septin9基因相应位点甲基化的细胞系DNA，RNF180基因和Septin9相应位点未甲基化的 WBC DNA。这些DNA均经过甲基化特异性PCR及测序方法验证。

阳性参考品包括9种，分别命名为阳性参考品P1-P9，其中阳性参考品P1-P3为一定DNA浓度不同的RNF180和Septin9双阳参考品；P4-P6为一定DNA浓度不同的RNF180单阳参考品；P7-P9为一定DNA浓度不同的Septin9单阳参考品。

阴性参考品包括3种，分别命名为阴性参考品N1-N3。阴性

参考品N1-N3为一定DNA浓度不同的RNF180和Septin9均为阴性的参考品。

精密度参考品包括1种，命名为精密度参考品J，为一定DNA浓度不同的RNF180和Septin9均为阳性的参考品。

检测限参考品包括3种，分别命名为检测限参考品S1-S3，其中检测限参考品S1为低DNA浓度的RNF180和Septin9双阳参考品；S2为低DNA浓度的RNF180单阳参考品；S3为低DNA 浓度的Septin9单阳参考品。

（二）生产工艺及反应体系研究

申请人对试剂盒反应体系的研究中包括靶标序列的选择、引物探针浓度的确定、DNA 聚合酶用量的确定、单多重体系的验证、PCR反应液、阴/阳性对照品配方的确定等；对 PCR 过程中的退火温度进行研究；完成样本的用量以及样本保存时间的研究；对该产品适配的两种仪器ABI7500以及ABI7500 Fast Dx 的检测结果的阈值进行了研究。

通过功能性实验，最终确定了最佳的反应体系。申请人根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。

（三）分析性能评估

本产品分析性能评估内容包括：试剂盒外观、准确度（阳性符合率、阴性符合率）、精密度、最低检测限的评估；对该试剂盒所适用的PCR仪机型ABI7500和ABI7500 Fast Dx进行了仪器评估;以及特异性研究（交叉反应和干扰试验等）在试剂盒外观的研究中，选择连续生产的三批次试剂盒，主要针对试剂盒组分是否齐全，包装外观清洁、无泄露、无破损，标志、标签字迹清楚等情况进行目视观察。结果显示试剂盒外观符合质量的要求。

阴阳性参考品符合率的方法是使用企业阴/阳性参考品分别对三个批次的试剂盒进行检测，记录每次实验Septin9、RNF180和ACTB 的Ct值，检测结果显示阳性符合率100%、阴性符合率100%。同时使用临床样本对试剂盒准确性进行了研究，结果显示试剂盒检测结果与一代测序结果一致。

精密度的研究使用了三种不同的样本，第一种样本是精密度参考品 J，三批次试剂盒分别在两种适配的仪器上进行检测。检测结果显示试剂盒检测的RNF180基因、Septin9基因和ACTB 基因的变异系数均小于等于5%。第二种样本是通过在临床正常人血浆样本中添加一定浓度的细胞系DNA模拟精密度企业参考品进行验证，检测结果显示RNF180基因、Septin9基因和ACTB 基因的变异系数均小于等于5%。第三种样本是通过临床胃癌混合血浆样本和临床正常人阴性混合血浆使用本试剂盒进行验证，结果显示RNF180基因、Septin9基因和ACTB基因的变异系数均小于等于5%。

最低检测限的研究中使用了三种不同的样本，第一种样本是通过配制不同浓度的阳性企业参考品，每种浓度下的参考品使用本试剂盒检测20次，检测结果显示，在细胞系DNA浓度为35pg/mL时，RNF180基因的阳性检出率100%，Septin9基因的阳性检出率100%，因此确定试剂盒最低检测限为35pg/mL。第二种样本是通过在临床正常阴性血浆中添加含35pg/mL的细胞系DNA，使用本试剂盒检测，结果显示RNF180基因和Septin9基因均为检测阳性。第三种样本是使用胃癌阳性血浆样本，进行稀释，通过相对定量方式确定，在35pg/mL浓度下，RNF180基因和Septin9基因均可检测为阳性。

对与本试剂盒联合使用并在说明书中推荐的血浆样本处理试剂（核酸提取试剂，京经械备20140053号，博尔诚（北京）科技有限公司）进行了游离DNA提取效率，亚硫酸盐转化效率的评估，与已上市产品对比，检测结果显示核酸提取效率与对比试剂一致，亚硫酸盐转化效率可达99.58%。

对该产品适配的两种仪器ABI7500以及ABI7500 Fast Dx 进行了性能评估，结果显示在两台机器上的阴/阳性符合率、最低检测限、精密度均符合质量要求，可以作为该产品的检测PCR仪。

对交叉反应的研究方法是使用RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）检测其他易产生交叉反应的肿瘤患者样本，确定甲基化肿瘤标志物RNF180、Septin9在其他恶性肿瘤中的表现。本研究选择肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌，共计9种癌症，使用RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行检测。根据实验结果，RNF180和Septin9在各大癌症中均有一定的检出率，除消化系统癌症较高外，其他癌症均有一定比例的检出，但远低于胃癌检出率。

在干扰试验的研究中，选取日常服用的药物和临床血浆中可能存在的常规物质，药物包括感冒药、消炎药、心脑血管疾病药、糖尿病药、胃病药、维生素、高血压药、安定药、镇痛药等，临床血浆中可能存在的常规物质包括未甲基化DNA、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、血清白蛋白、红细胞、胆固醇、尿酸和葡萄糖，以及临床采血管中存在的抗凝剂K2EDTA等，验证结果显示，维生素C（300mg/2000ml）、双氢氯噻嗪（100mg/2000ml）、阿托伐他汀钙片（80mg/2000ml）、阿司匹林（8000mg/2000ml）、盐酸二甲双胍片（2000mg/2000ml）、奥美拉唑（120mg/2000ml）、头孢曲松钠（4000mg/2000ml）、对乙酰胺基酚（2000mg/2000ml）、阿莫西林（4000mg/2000ml）、甲硝锉（3600mg/2000ml）、地西泮片（40mg/2000ml），胆红素（20 mg/dl）、胆固醇（500 mg/dl）、葡萄糖：（1000 mg/dl）、血红素(1000 mg/dl）、人血清白蛋白（4000 mg/dl）、甘油三酯（1200 mg/dl）、尿酸（1.4mmol/l =23.5 mg/dl）、K2EDTA（2000 mg/dl）、红血球（0.4% v/v）、Septin9和RNF180区域未甲基化的WBC DNA （35ng/ml）对本试剂盒的检测无影响。

（四）阳性判断值或参考区间研究

申请人采用 ROC 曲线法确定阳性判断值。申请人采用本产品对 961 例临床样本进行检测，其中包括其中胃癌样本393例（I期66例、II期68例、III期173例、IV期33例、分期不明53例），浅表性胃炎样本184例，萎缩性胃炎样本170例，其他胃部疾病样本39例，其他癌症样本175例（大肠癌、食管癌、胰腺癌等）。

试验结果显示 ACTB 基因的 Ct 值≤34.8时，样本检测结果有效。在确定样本检测结果有效的情况下，确定了针对RNF180基因的Cutoff值为dCt≤9.0、Septin9基因的Cutoff值为Ct 值≤45.0，同时由于本产品采用三平行重复的复孔检测，单个基因的结果在2/3阳性或3/3阳性时，判定为检测阳性。当RNF180基因、Septin9基因分别有一个为检测阳性或两个均为检测阳性时，可判定为检测阳性。

（五）稳定性研究

申请人对该产品的稳定性的研究包括货架效期稳定性、反复冻融稳定性、运输稳定性、血液样本的稳定性、血浆样本的稳定性及BisDNA的稳定性。

货架效期稳定性：选择三批次试剂盒置于-25℃～-15℃冰箱中保存，在储存后的第0、3、6、9、12、13、14个月后进行检测，对企业参考品及阴/阳性对照品检测的结果结果显示：产品在生产后 14 个月的产品性能满足质量的要求，试剂性能稳定。产品有效期可达 12 个月。

反复冻融稳定性：使用三批次试剂盒在规定的储存条件下，取出试剂盒反复冻融 3 次，检测每次冻融后的试剂盒的稳定性；对企业参考品及阴/阳性对照品检测的结果表明试剂盒在反复冻融 3次的条件下的产品性能均能够满足质量的要求。因此声称本试剂盒在冻融两次条件下的稳定性良好。

运输稳定性：取三批次RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）使用泡沫加干冰装填包装后，用快递寄至外地未开箱再寄回本公司共7天，运输完成后，放置于-25℃～-15℃的冰箱中储存，在第12个月过后，进行检测。对企业参考品及阴/阳性对照品检测的结果表明该产品在干冰运输的条

件下运输7天以及在效期末的检测结果的各项性能指标均能够满足质量的要求。

申请人对血液样本、血浆样本及BisDNA的样本稳定性进行研究，研究结果表明全血采集后的血液样本，最好应立即放入到2～8℃冰箱保存，血浆样本的储存条件为-25～-15℃，且在14天内血浆样本稳定性良好，BisDNA可在2～8℃保存24小时，-25～-15℃保存72小时稳定性良好。

三、临床评价摘要

（一）临床总研究结果分析

申请人在中国人民空军军医大学第一附属医院、北京肿瘤医院、天津市肿瘤医院、西安交通大学第二附属医院、厦门大学附属中山医院、中国医学大学附属第一医院共六家临床试验机构完成了临床试验。采用胃镜和/或病理的等临床诊断结果为对照方法，对比验证考核试剂的有效性和安全性，从而评估考核产品的临床性能。

通过采用盲法、对照的试验设计共筛选有效病例1382例。其中胃癌病例680例，非胃癌病例702例。胃癌病例涵盖了胃癌不同分期的患者，占总入组病例数的49.20%（680/1382）。非胃癌病例包括交叉反应人群样本共702例，其中含对照组共536例（包括：浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃息肉、肠化生、低级别内瘤变、其它胃良性疾病及其它疾病（胃溃疡、糜烂性胃炎等）和良性肿瘤），166例其它癌症样本（包括主要高发癌症：肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌和肠癌；还有发病率较低的癌症：胰腺癌和卵巢癌）。

以胃镜和/或病理结果检测结果为参照，计算考核试剂盒的符合率、灵敏性与特异性等指标。临床试验结果显示，考核试剂对胃癌的检测灵敏性为61.76%（420/680），特异性为85.07%（456/536）。对六家临床试验机构入组的680例不同分期胃癌患者结果分别进行统计。由结果可见，经胃镜和/或病理结果确定为病例组的样本共680例，试剂盒检出I期灵敏性为50.00%，Ⅱ期的灵敏性为62.32%，Ⅲ期的灵敏性为67.68%，Ⅳ期的灵敏性为82.00%，分期不明灵敏性为55.88%。

在临床试验中，对比分析同时有其他肿瘤标志物结果和考核试剂盒检测结果的样本（目前临床中常用的肿瘤标志物主要有 AFP、CEA、CA199、CA125、CA724 等）。

对各肿瘤标志物对样本各分期的阳性率进行统计，且与试剂盒的阳性率对比情况见图1：

图1 标志物检出率比对

由结果可见，考核试剂盒对病例组的检测灵敏性比传统蛋白肿瘤标志物高。

（二）临床前瞻性研究结果分析

对临床试验中易患胃癌需要胃镜检查的433例受试者进行了前瞻性的结果分析，这些受试者是需要进行胃镜检查的易患胃癌的受试者（易患胃癌），按照双盲法入组的，在接受本检测前入组工作人员和检测人员并不知道受试者是否患有胃癌，这些受试者是本产品预期用途中对应的需要胃镜检查的易患胃癌的人群。

前瞻性的结果分析是对临床试验中433例易患胃癌需要胃镜检查的受试者通过胃镜和/或病理诊断结果进行样本分组，胃癌病例组为124例，对照组为309例。其中对照组样本包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎、其它胃良性疾病及其它疾病、胃息肉、肠化生、良性肿瘤（胃部良性肿瘤及其它良性肿瘤）等。

以胃镜和/或病理结果检测结果为参照，计算考核试剂盒的符合率、灵敏性与特异性等指标。前瞻性的分析结果是：本试剂盒对易患胃癌需要胃镜检查受试者中胃癌患者检测的灵敏性及特异性分别为62.10% 和85.44%，这两个数据和含有确诊胃癌受试者的总体临床试验中对胃癌患者检测的灵敏性和特异性（61.76%和85.07%）数据相近。

按照临床试验分组标准，易患胃癌需要胃镜检查的受试者共计433例入组，经分析后可见入组者均为胃部相关疾病，其中富集了胃癌的患者，有124例，基本排除了其他癌症样本入组的可能性，如肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等。由于在易患胃癌需要胃镜检查的人群中富集了患有胃癌的人群，在Septin9检测阳性受试者中，未发现肠癌和其他癌症患者，在RNF180检测阳性受试者中，也未发现其他癌症患者，说明尽管Septin9和RNF180在其他癌症中有略升高或较高的检出率，但是在本产品预期用途的易患胃癌需要胃镜检查的人群中，由于其他癌症多不具备胃癌的症状而被排除在外。进一步提示在本产品预期用途的易患胃癌需要胃镜检查的人群中使用本产品，由于主要人群为患有胃癌的人群，对患有胃癌人群的检测机会得到提高；同时，由于有效的排除了患有其他癌症的人群，对其他高发癌症如肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等接受本产品检测的机会相对降低，从而减少了其他癌症对本产品检测胃癌这一预期用途的影响。

对易患胃癌并需要胃镜检查的受试者也进行了目前临床中常用的肿瘤标志物如AFP、CEA、CA199、CA125、CA724 等的分析, 因这几种肿瘤标志物并非每个入组的受试者都检测,我们选取有同时有其他肿瘤标志物结果和甲基化检测结果的样本,做对比分析。结果显示，本产品比传统肿瘤标志物的灵敏性高。这一结果也符合总体临床试验中的结果。

（三）临床回顾性研究结果分析

除去前瞻性样本433例，回顾性样本共计783例，这些回顾性样本是按照单盲法入组的已知胃镜结果的受试者，在接受本检测前入组工作人员已知受试者是否患有胃癌，而检测人员并不知道受试者是否患有胃癌。通过胃镜和/或病理诊断结果进行样本分组，病例组为556例，对照组为227例。其中对照组样本包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎、其它胃良性疾病及其它疾病、胃息肉、肠化生、良性肿瘤（胃部良性肿瘤及其它良性肿瘤）等。

试剂盒检测结果为阳性的共378例：其中病例组有343例，对照组有35例；试剂盒检测结果为阴性的共405例：其中病例组有213例，对照组有192例。以胃镜和/或病理结果检测结果为参照，计算考核试剂盒灵敏性与特异性等指标。回顾性样本的分析结果是：灵敏性为61.69%，特异性为84.58%。

这两个数据与上述前瞻性样本分析中易患胃癌需要胃镜检查的人群检测的灵敏性和特异性（62.10% 和85.44%）以及总体临床试验中对胃癌患者检测的灵敏性和特异性（61.76%和85.07%）数据接近。

对回顾性样本也进行了目前临床中常用的肿瘤标志物如AFP、CEA、CA199、CA125、CA724 等进行分析, 因这几种肿瘤标志物并非每个入组的受试者都检测,我们选取同时有其他肿瘤标志物结果和甲基化检测结果的样本,做对比分析。结果显示，本产品比传统肿瘤标志物的灵敏性高。这一结果与前瞻性样本分析结果一致，同时也符合总体临床试验中的结果。

（四）相关因素分析

申请人对临床试验中的受试者年龄分层进行了统计：其中≥40岁的病例组651例，对照组428例，正常人124例；≥50岁的病例组581例，对照组283例，正常人69例；统计结果显示，以40岁和50岁为分界点，≥40岁人群和≥50岁人群的阳性率，在病例组、对照组中均没有差异。

申请人对临床试验中的受试者性别进行了分层统计：病例组分别收集了493例男性、187例女性，对照组242例男性、294例女性，正常人群66例男性、120例女性，符合胃癌的流行病学特征。统计结果显示，对照组中男性和女性的阳性率无明显差异；病例组中女性检测阳性率略高于男性。

四、风险分析及说明书提示

本产品根据“YY/T 0316-2016 医疗器械风险管理对医疗器械产品的安全风险分析方式，对RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行风险分析。

（一）受益评估

世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014显示》，胃癌新增和死亡人数占比已超过了40%。东亚地区是胃癌高发区，中国、日本、韩国3个国家的胃癌总人数约占全球的70%左右。目前胃癌检测的金标准为胃镜检查，常规肿瘤标志物对胃癌的平均检出率不到20%。该试剂盒适用于经临床医师诊断建议胃镜检查同时由于患者个人原因拒绝进行胃镜检查的患者，患者最终诊断应依据胃镜检查结果。基于现有临床试验结果，对胃癌的临床灵敏度为61.76%，特异性为85.07%。

（二）风险评估

申报产品检测结果会受到样本类型、样本制备和保存、实验操作、实验环境等，导致可能出现检测结果无效。使用者需了解检测过程中可能存在的潜在风险和检测方法的局限性。

申报产品不直接接触患者，但需医院专业人员采取患者血液样本，交由专业人员来实现预期用途。

申报产品对环境无影响，但是推荐使用的血浆处理试剂盒中含有TRIS-盐酸、异硫氰酸胍、亚硫酸氢氨、四氢糠醇，推荐产品使用中及使用后废物的不适当处理有可能会造成环境的污染。

申报产品使用后无需特殊的退出模式。使用后产生的废物需按医疗垃圾做专业处理，以防止造成医源性污染。

申报产品的使用无需安装，但需对市用制进行专门的培训。产品的成功使用，取决于操作员的正确使用，因此再说明书中详细列出了正确操作的注意事项。

申报产品通过原材料、配制、检测、标志、包装、运输、使用方法及安全注意事项、保存和用后处理等全过程危害判定、风险估计、预防化解，从注册产品标准和使用说明书及企业规章制度对产品质量的全过程和风险防范措施，可以看出，申报产品的安全风险降到了可以接受的程度，能达到市用制可接受的水平，同时没有带来新的危害与安全风险。在目前认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。

产品说明说中对于安全风险的提示信息如下：

1. 采集后的血样应立即离心制备血浆，如不能及时处理，并于30分钟内放入2～8℃冰箱，且在2～8℃温度下保存的时间不超过8小时，不得冰冻血样。

2. 禁止使用离心机刹车（急停）功能，以防止破坏血细胞层。

3. 制备好的血浆样本应立即放入-25～-15℃冰箱中，保存不超过2周。

4. 若BisDNA不立即使用，可在2～8℃存储24小时，或在-25～-15℃存储72小时。

5. 配制好的PCR预反应液应立即使用。PCR反应液和聚合酶使用完毕立即复冻。

6. 每一管PCR反应液冻融次数不超过2次，使用两次后剩余的残液应丢弃。

7. 应减少实验样本中的交叉污染，包括DNA提取，亚硫酸盐转化和DNA洗涤等过程。

8. 为防止在DNA提取过程中核酸酶混入样本，我们建议使用一次性的移液管和移液器头，这样可以避免不同样本间的交叉污染。检测实验应该由精通DNA提取和real-time PCR分析的专业人员完成。

9. 为防止PCR扩增产物的污染，我们建议严格区分PCR步骤，分为PCR扩增前（血浆DNA的提取，纯化和PCR设置）和PCR扩增（如real-time PCR）。使用过的PCR平板应该置于一个不利于PCR产物扩散的地方，例如使用过的PCR平板从PCR 仪取出之后，应立即置于自封袋中，封紧，并丢弃在指定的容器中。绝不要把使用后的PCR平板放在PCR仪外面，也不要打开用过的PCR平板。

10. 产物中不含有任何具有感染性的物质，不会感染人体或其他动物。受检人血样应视为潜在的感染源，其操作应在具有生物安全标识和具有生物安全防护条件的微生物和生物医学实验室进行，以保护操作人员在工作时不会受到潜在感染源的影响。

11. 产品的说明书中同时描述了相关注意事项。

综合评价意见

本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，属于创新审批项目（编号：201700027）。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（令第680号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令2014年第5号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。

2020年04月24日附件：产品说明书RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）说明书

【产品名称】

通用名称：RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）

【包装规格】

30人份/盒

【预期用途】

该产品用于体外定性检测人血浆中甲基化的RNF180及Septin9基因。

该产品适用于经临床医师诊断建议胃镜检查同时由于患者个人原因拒绝进行胃镜检查的患者。检测结果阳性不作为胃癌早期诊断或确诊的证据，检测结果阴性也不能排除胃癌的可能，患者最终诊断应依据胃镜检查结果。该产品不用于普通人群的肿瘤筛查。基于现有研究，仅限于有胃癌家族史者或40岁以上胃癌高风险人群检测。

胃癌按《恶性肿瘤 TNM 分类法》的分期，在癌症早期几乎不会有症状，以消瘦为最多，其次为胃区疼痛、食欲不振、呕吐等。早期胃癌的首发症状，可为上腹不适(包括上腹痛，多偶发)，或饱食后剑突下胀满、烧灼或轻度痉挛性痛，可自行缓解；或食欲减退，稍食即饱。少数患者因上腹部肿物或因消瘦，胃穿孔或转移灶而就诊。但常因症状轻微和不典型而被忽视。RNF180（ring finger protein 180）是肿瘤抑制因子，RNF180启动子甲基化在胃癌组织中导致RNF180低表达或不表达，通过HGF、CCR-7、MMP-2、VEGF等多条信号通路促进胃癌细胞的发生及增殖。Septin9是Septin基因家族的一个成员，该基因家族至少有13个基因组成，它们编码保守的GTPase结构域，可以结合细胞骨架相关的蛋白质，和细胞与肿瘤发生相关。研究发现，在胃癌患者血浆样本中甲基化的RNF180及Septin9基因含量特征性增高。【检验原理】

RNF180/Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）包括两个步骤。步骤1，使用血浆游离DNA提取试剂盒提取血浆中的游离DNA，然后用亚硫酸盐转化未发生甲基化的胞嘧啶，通过脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐，发生甲基化的胞嘧啶则不会被亚硫酸盐转化；步骤2，甲基化的DNA做三重PCR扩增，PCR反应中的阻断剂和探针能区分甲基化和非甲基化序列，甲基化序列得到扩增，与甲基化RNF180基

因和Septin9基因序列特异性结合的荧光素探针可以在PCR反应中专一地检测出甲基化序列。内对照ACTB（ß-actin）基因用于评估检测中DNA量是否足够。试剂盒中提供了阳性和阴性对照，两者在每一次检测中都需要同时加入。

【主要组成成分】

以下试剂和耗材是本试剂盒不包含，但对该实验必需的：

●血浆游离DNA提取和亚硫酸盐转化试剂盒（推荐使用试剂盒名称：核酸提取

试剂；备案号：京经械备20140053号；公司名称：博尔诚（北京）科技有限公司））

●无水乙醇（分子生物级别，浓度高于99.5%）；

●15 mL聚丙烯离心管带有圆锥型底，无菌；

● 2.0 mL离心管，圆底带有联体螺旋型的密封盖；

●带有过滤装置的吸头，包括2-100 μL、50-1000 μL规格；

●连续分液器头，包括0.5 mL、1 mL、10 mL、25 mL规格；

●一次性移液器，可以非无菌包装，长度15cm，体干直径5mm，能吸取

5 mL液体；

●存储DNA的96孔板；包括0.1mL、0.2mL规格；

●96孔板密封膜；

●96孔板密封膜的手动压膜器；

●可再封闭型塑料袋；10 × 15 cm；

●可竖立的5 mL密封冻存管；

●采血管：如BD的10 mL，K2EDTA负压抗凝管。

【储存条件及有效期】

试剂盒有效期为12个月。请勿使用过期的试剂。不同批次的试剂盒不能混用。

试剂盒于-25~-15℃条件下存储。

每一管PCR反应液冻融次数不超过2次，使用两次后剩余的残液应丢弃。

生产日期及失效日期详见产品标签。

【适用仪器】ABI 7500、ABI 7500 Fast Dx。

【样本要求】

血样的收集和存储按以下执行：

1、全血采集

●采血量：10mL。

●采血方法：使用K2EDTA抗凝采血管(如BDVacutainer® K2EDTA 10mL采血

管)采血。

●采集后的血样应立即离心制备血浆，如不能及时处理，并于30分钟内放入

2~8℃冰箱，且在2~8℃温度下保存的时间不超过8小时，不得冰冻血样。

2、血浆样本的制备和保存

●禁止使用离心机刹车（急停）功能，以防止破坏血细胞层。

●离心装有全血的采血管12分钟，离心力1350±150rcf。从离心机中取出采血

管，用一个干净的15cm一次性移液管把血浆转移到聚丙烯材质、圆锥底的

15 mL离心管中。

●离心血浆12分钟，离心力1350±150rcf。用新的一次性移液管或者血清移液管

将3.5 mL血浆移入标记好的圆锥底的离心管中。

●制备好的血浆样本应立即放入-25~-15℃冰箱中，保存不超过2周。

【检验方法】

1.血浆游离DNA的提取

●按说明书的要求进行游离DNA的提取和亚硫酸盐的转化。

●若BisDNA不立即使用，可在2~8℃存储24小时，或在-25~-15℃存储72小

时。

2. PCR检测

2.1. PCR预反应液的准备

●BisDNA样本：病人样本、阳性对照品、阴性对照品实行三次PCR平行测试。

●根据反应样本量，融化相应管数的PCR反应液，1管PCR反应液最多用于16

个样本（包括阳性对照品和阴性对照品）。涡旋混匀PCR反应液10~15秒，短暂离心。

●每个PCR反应需要19.2 µLPCR反应液和0.8 µL聚合酶按表1的比例将相应

体积的PCR反应液和聚合酶加入到2.0 mL的离心管中。涡旋混匀PCR预反应液，短暂离心离心管，将管壁液滴离下来。

表1 PCR预反应液的准备

注意: 配制好的PCR预反应液应立即使用。PCR反应液和聚合酶使用完毕立即复冻。

2.2. PCR反应板准备(Applied Biosystems 7500/Applied Biosystems 7500 Fast Dx)

●每个样本需要3次PCR平行反应，在96孔板孔中，每个PCR反应孔中加入

18 µL PCR预反应液和12 µL的BisDNA。

●用MicroAmp® Optical Adhesive Film胶膜密封，1000±100rcf离心1分钟。密

封后的PCR板可在2~8℃放置不超过4小时。

2.3 PCR扩增

●软件要求

PCR过程可使用Applied Biosystems 7500，该仪器适配软件为SDS V2.0及以上版本。

PCR过程可使用AppliedBiosystems 7500 Fast Dx，该仪器适配软件为SDS V1.4软件及以上版本。

●PCR反应板加载

Passive Reference设置必须为“none”，Septin9选取FAM通道，RNF180选取ROX通道，ACTB选取JOE通道，如表2所示设置反应程序：

表2 反应程序

注：X代表荧光收集阶段

3.分析条件设置

3.1Applied Biosystems 7500设置

●设置基线10-22个循环，设置ACTB阈值8000，RNF180阈值为8000，Septin9

阈值16000。[*]

●用对照品验证PCR反应的有效性：阳性对照品和阴性对照品的三次PCR重复

均满足表2的参数要求时,则认为本次PCR反应有效。

3.2Applied Biosystems 7500 Fast Dx设置●设置基线10-22个循环，设置ACTB阈值30000，RNF180阈值25000，Septin9

阈值75000。[*]

●用对照品验证PCR反应的有效性：阳性对照品和阴性对照品的三次PCR重复

均满足表3的参数要求时,则认为本次PCR反应有效。

[*]：相同机型的不同机器，由于机器运行时间不同，分析时阈值可作适当调整。

表3 PCR反应有效性参数信息

【质量控制】

1. 外源对照

该试剂盒包含阳性对照品和阴性对照品。应在每次反应中添加这些对照品以检测反应是否成功，同时确保反应的有效性。阳性对照品和阴性对照品的反应Ct值应该在有效范围内，如表3，如果反应Ct值在其有效范围之外，此次测试结果无效。

2. 内源对照

内源对照能够检测亚硫酸盐转化的ACTB（ß-actin）DNA，同时能够检测样品是否满足实验要求（包括样本制备是否正确，样本DNA含量是否满足要求）。

如表3，RNF180和Septin9 PCR反应的结果与ACTB PCR结果的Ct值相关。如果ACTB PCR结果的Ct值超出有效范围，则反应无效。因为过高的ACTB Ct 值表示BisDNA浓度过低或者PCR反应的抑制。

【阳性判断值】

单次PCR结果的判定见表4：

表4 单次PCR反应的结果解释

*RNF180的Ct值与ACTB的Ct值差值。

注意：单次PCR结果的阴阳性以Ct值为判定标准，而不以S型曲线判定。

【检测结果的解释】

1.如果RNF180三次重复PCR反应中有两次或三次检测阳性，则样本的RNF180测试结果为“阳性”；如果RNF180三次结果有两次或三次为检测阴性，则样本的RNF180测试结果为“阴性”。见表5：

表5

样本中RNF180结果判读

2.如果Septin9三次重复PCR反应中有两次或三次检测阳性，则样本的Septin9测试结果为“阳性”；如果Septin9三次结果有两次或三次为检测阴性，则样本的Septin9测试结果为“阴性”。见表6：

表6

样本中Septin9结果判读

3.如果结果为其它情况，视为无效。

4.如果样本中按表5和表6判断RNF180和Septin9中任意一个为检测阳性，则判定该样本为检测阳性。

5.如果样本中RNF180和Septin9同时为检测阴性，则判定该样本为检测阴性。见表7：

表7 样本RNF180和Septin9检测结果联合判读

【检测方法的局限性】

1. 本试剂盒不包含血浆游离DNA提取和亚硫酸盐转化试剂盒，推荐使用本公司生产的“核酸提取试剂”。

2. 该产品的使用者应该是接受过PCR反应训练的试验者。

3. 由于胃癌检测依赖于样本中肿瘤DNA的量、所以可能受样本收集过程、样本储存方式、病人个体因素（如年龄，其它疾病）以及肿瘤级别影响。样本的收集请严格按照【样本要求】中的要求进行。

4. 此结果不能作为确诊胃癌的证据。任何甲基化RNF180和Septin9基因检测呈阳性的患者还需接受胃镜的进一步检查以便确诊。

5. 其他消化道肿瘤如大肠癌、肝癌和食道癌会有一定检出。

6. 因为胃癌的发病率会随着年龄的增长而发病人群会显示增加，低年龄段相关人群胃癌发病率低于高年龄段人群，低年龄段相关人群胃癌发病率低而导致的阳性预测值偏低，普通人浅表性胃炎也有百分之十几的该指标阳性检测率。为避免因可能导致过高的假阳性风险，故不建议在低年龄段相关人群中进行该检测。

7. 该甲基化基因RNF180和Septin9基因检测试剂盒的检测结果应结合其它临床指标进行评估。

8. 通过上千例临床试验证实，试剂盒测试胃癌的灵敏度为61.76%，特异性为85.07%。

9. 胃部不适症状可能由多种原因引发，如胰腺癌、结肠癌等。本试剂盒为胃镜检查的补充手段，临床医师应结合做胃镜的临床指征，选择是否采用本试剂盒检测。10. 胃低级别内瘤变会有一定例数检出，胃高级别内瘤变会有较高漏检。

【产品性能指标】

1．产品的性能指标

1.1最低检出限

测定检测限企业参考品(S1-S3)，结果为S1:RNF180阳性、Septin9阳性,S2: RNF180阳性、Septin9阴性，S3: RNF180阴性、Septin9阳性。

1.2精密性

对精密度企业参考品(J)进行重复10次测试，全部为RNF180阳性、Septin9阳性，计算所测得RNF180、Septin9及ACTB Ct值的变异系数（CV），均应不高于5%。

1.3阳性符合率

检测9份阳性企业参考品(P1-P9)，阳性符合率为100%。

1.4阴性符合率

检测3份阴性企业参考品(N1-N3)，阴性符合率为100%。

2．其它干扰

干扰实验显示，样本中含有以下干扰物：未甲基化DNA（100ng/mL）、胆红素（0.20mg/mL）、血红蛋白（10mg/mL）、甘油三酯（12mg/mL）、蛋白（血清白蛋白，40mg/mL）、红细胞（0.4% v/v）、K2EDTA（20mg/mL）、胆固醇（5mg/mL）、尿酸（0.235mg/mL）和葡萄糖（10mg/mL），对检测结果无影响。

3. 交叉反应情况

3.1 在以下临床诊断的疾病：慢性胃炎、肝癌、食管癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌等患者中，已观察到阳性检测结果。

3.2 胃部不适症状可能由多种原因引发，如胰腺癌、结肠癌等。

4. 临床情况

4.1 通过1382例临床试验证实，试剂盒测试胃癌的灵敏度为61.76%，特异性为8

5.07%。

4.2 本试剂盒对病例组的检测灵敏度比传统蛋白肿瘤标志物高40%左右，其中在I期灵敏度比传统蛋白肿瘤标志物高40%左右，II期灵敏度比传统蛋白肿瘤标志物高50%左右。

4.3 本试剂盒检测年龄40岁以上和50岁以上组无明显差异，建议检测年龄为40岁以上人群；对照组中男性和女性的阳性率无差异；病例组中女性检测阳性率略高于男性。

4.4 本试剂盒对临床试验中前瞻性样本检测胃癌的灵敏性为62.10%，特异性为8

5.44%。

4.5 本试剂盒对临床试验中回顾性样本检测胃癌的灵敏性为61.69%，特异性为84.58%。

【注意事项】

1. 只能用于体外诊断。

2. 实验室注意事项

应减少实验样本中的交叉污染，包括DNA提取，亚硫酸盐转化和DNA洗涤等过程。

为防止在DNA提取过程中核酸酶混入样本，我们建议使用一次性的移液管和移液器头，这样可以避免不同样本间的交叉污染。检测实验应该由精通DNA提取和real-time PCR分析的专业人员完成。

为防止PCR扩增产物的污染，我们建议严格区分PCR步骤，分为PCR扩增前（血浆DNA的提取，纯化和PCR设置）和PCR扩增（如real-time PCR）。使用过的PCR平板应该置于一个不利于PCR产物扩散的地方，例如使用过的PCR平板从PCR仪取出之后，应立即置于自封袋中，封紧，并丢弃在指定的容器中。绝不要把使用后的PCR平板放在PCR仪外面，也不要打开用过的PCR平板。

3. 微生物及感染状态

产物中不含有任何具有感染性的物质，不会感染人体或其他动物。受检人血样应视为潜在的感染源，其操作应在具有生物安全标识和具有生物安全防护条件的微生物和生物医学实验室进行，以保护操作人员在工作时不会受到潜在感染源的影响。

【标识的解释】

无

【参考文献】

1. Kin-Fai Cheung, Cleo N. Y. Lam,et al. Characterization of the Gene Structure,Functional Significance, and Clinical Application of RNF180, a Novel Gene in Gastric Cancer. Cancer, February 15, 2012:p. 947-959.

2. Jingyu Deng, Han Liang,etal，Methylation of CpG sites in RNF180 DNA promoter prediction poor survival of gastric cancer .Oncotarget, V ol. 5, No. 10: p. 3173-318

3.【基本信息】

注册人/生产企业名称：博尔诚（北京）科技有限公司

住所：北京市北京经济技术开发区宏达南路18号院3号楼10层

联系方式：

售后服务单位名称：

联系方式：

生产地址：北京市北京经济技术开发区宏达南路18号院4号楼3层、2号楼501-504室、1幢-1层-101 A区和B区

医疗器械生产许可证编号：

【医疗器械注册证书编号/产品技术要求编号】

【说明书核准及修改日期】