转录组测序研究方案

一、什么是全转录组？

全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下转录出的所有转录本信息的总和，包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA等编码和非编码RNA。转录组学作为科学研究的基础，其研究意义的重要性众所周知。

二、为什么做全转录组测序？

想解答这个问题，咱们先来聊聊什么是ceRNA。

ceRNA (competing endogenousRNA，竞争性内源RNA) 并不是新的RNA分子，而是一种全新的基因表达模式，ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。

ceRNA—竞争性内源RNA

mRNA或ncRNA上存在可被miRNA结合的区域，即MREs功能元件，包含同源MREs的RNA分子可竞争性的结合miRNA。已知miRNA可通过结合靶基因导致基因沉默，所以ceRNA可以通过竞争性地结合miRNA来靶基因的表达[1]。

目前，单一的mRNA或ncRNA研究已不能满足科研需求，结合多种RNA信息进行ceRNA联合分析，探究其潜在的网络机制已成为解释生物学现象的利器！

三、全转录组测序怎么做？

全转录组测序即应用RNA-seq技术，通过构建两种文库—小RNA文库和去核糖体的链特异性文库，可一次性分析4种RNA (miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA) 信息。

3.1分析内容

全转录组分析内容更全面，除4种RNA标准分析外，还包含ceRNA联合分析。

全转录组测序信息分析流程

ceRNA互作网络[2]

3.2 研究思路

全转录组测序研究思路

1）确定研究对象

对照组&处理组；健康组&疾病组；癌组织&癌旁组织……

2）应用RNA-seq获得4种RNA数据

3）筛选差异表达的mRNA，lncRNA，miRNA，circRNA

4）构建ceRNA网络，筛选ceRNA-mRNApairs

5）QRT-PCR验证其表达量相关性

6）ceRNA关系验证

a. 从蛋白水平、RNA水平等验证ceRNA对靶标基因的作用；

b. 分析miRNA结合位点，ceRNA-miRNA关系；

7）功能验证

a. 细胞水平：细胞增殖，细胞凋亡及周期变化，肿瘤转移等；

b. 分子水平：Western Blot和免疫组化，siRNA干扰/过表达载体，免疫沉淀（IP）等；

c. 动物实验：构建动物模型，肿瘤模型；

d. 临床层面：检测动物表型及生化指标变化，术后恢复情况。

3.3 案例解析

Nature communications的两篇文章，分别以lncRNA，circRNA为主要研究点，结合mRNA，miRNA数据进行ceRNA分析，探究其机制。

1. 前列腺癌中lncRNA介导的sponge网络[3]

研究表明，lncRNA可作为miRNA海绵竞争性结合mRNA。文章通过生物信息学分析筛选到2个sp-lncRNA，并确定PTEN为其基因，通过miRNA发挥作用，从而表明lncRNA介导的海绵网络在癌症中发挥重要作用。

2. circRNA的miRNA海绵作用机制[4]

文章应用RNA-seq技术筛选差异circRNAs，确定circHIPK3为目标分子，并进行鉴定及生成、胞内定位等研究；通过miRNA结合位点分析并结合多重实验验证，表明circHIPK3可作为miRNA海绵发挥作用。

四、参考文献

[1] Thomson DW, Dinger ME. Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy[J]. Nat Rev Genet, 2016, 17(5): 272-283.

[2] Huang M, Zhong Z, Lv M, et al. Comprehensive analysis of differentially expressed profiles of lncRNAs and circRNAs with associated co-expression and ceRNA networks in bladder carcinoma[J]. Oncotarget, 2016.

[3] Du Z, Sun T, Hacisuleyman E, et al. Integrative analyses reveal a long noncoding RNA-mediated sponge regulatory network in prostate cancer [J]. Nature communications, 2016, 7.

[4] William RJ, Jessica SR, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs [J]. Nature communications, 2016,4.