OX40_OX40L信号途径在移植免疫中的作用

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　　摘要：OX40(CD134)和他的配体OX40L（CD252）都是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体和肿瘤坏死因子超家族的成员，在活化的CD4+T 细胞和CD8+T 细胞以及其他一些淋巴和非淋巴细胞中表达，OX40 与OX40L 结合后为抗原识别过程提供第二信号，在促进CD4+T细胞增殖、抑制调节性T 细胞功能和记忆性T 细胞产生的过程中发挥着重要作用。

　　关键词：共刺激信号；OX40；OX40L

　　0 引言

　　OX40 最初被认为是T 细胞活化的标志物[1]，经过克隆鉴定表明他是神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族的成员，具有共刺激功能[2]。OX40 能够在活化的CD4+T 细胞和CD8+T 细胞诱导表达，但在静止的原始T 细胞或大部分静止的记忆T 细胞不表达[3]。OX40的配体OX40L 最初被认为是糖蛋白34，后来发现它能够与OX40 结合[4]。OX40L 能够在抗原呈递细胞诱导表达，其功能是抗原识别导致的T 细胞激活[5]。

　　受抗原刺激后，OX40 迅速在活化的幼稚CD4+和CD8+T 细胞诱导表达。体内、体外实验均表明活化后最初1 小时内OX40 的表达量比较少，而在受刺激后的24 小时到4-5 天都有可能出现OX40 表达高峰[6]。OX40 功能的行使离不开OX40L，APC 细胞（如DC 细胞和B 细胞）活化后24 小时内OX40L 就可以被诱导表达[7]。

　　OX40/OX40L 信号途径的作用机制是：OX40 通过结合OX40L 活化后,可诱导磷脂酶C2γ等磷酸化、增强三磷酸肌醇活性、升高细胞内Ca2+浓度、活化蛋白激酶C 等促进T 细胞的活化和Th 细胞的分化。OX40 使T 细胞大量扩增和存活的原因是OX40 信号可以通过增强抗凋亡分子clxL、Bcl-2 及BFL1 的表达,而发挥抑制凋亡、维持T 细胞存活的作用。

　　1 OX40 促进效应T 细胞增殖和存活

　　T 细胞受到急性抗原刺激发生的反应分为3 个阶段：增殖、分化和产生记忆。遇到抗原之后原本低增殖的幼稚T 细胞分化成大量增殖的效应T 细胞。这种效应细胞的数量远大于原来的细胞群[8]，在抗微生物、抗肿瘤、自身免疫疾病、移植物排斥中具有很重要的作用。OX40 在这一过程中发挥了重要的作用，既能够CD4+ T 细胞克隆增殖，也能够CD8+ T 细胞克隆增殖。对于OX40–OX40L 间相互作用最初的研究表明，当OX40L 与B7.1共表达时能够给抗原反应性幼稚CD4+T 细胞提供协同的共刺激信号，以延长T 细胞增殖的时间，并产生更多的细胞因子[9]。通过OX40 基因敲除动物模型的研究表明，OX40 基因敲除后，免疫引发的初始效应CD4+T 细胞的数量显著减少；通过在野生型小鼠体内给予OX40激活型抗体可以强效地增加抗原特异性效应T 细胞的生成，并能防止T 细胞耐受的发生[10]。对OX40L 缺陷小鼠或OX40L 抗体封闭小鼠的研究结果发现，CD4+ T 细胞扩增或功能分化降低[11]。相反，OX40L 转基因小鼠由于DC 细胞或者T 细胞持续过量表达OX40L，能够显著增加效应性CD4+ T 细胞的数量[12]。在对OX40 缺陷的TCR 转基因CD4+ T 细胞体内和体外模型进行的研究表明，受到高亲和力抗原肽刺激后，OX40 对CD4+T 细胞的初始活化和增殖不起控制作用，但是OX40 可以产生信号用来保持晚期增殖和延长T 细胞在效应期的存活时间[13]。OX40 的这些活性与OX40 的靶分子有关，这些靶分子包括调节细胞周期进程的因子和抑制凋亡的因子。当CD4+ T 细胞被抗原低强度激活时（弱TCR 信号），OX40缺陷仍可明显减少CD4+ T 细胞的早期增殖，这可能与调节性T 细胞（Treg）生成增加或IL-4产物减少有关。OX40 信号同样可以直接增加抗原刺激后的CD8+T 细胞的增殖和存活时间[14]。但OX40 对CD4+T 细胞和CD8+T 细胞产生作用的时间不同，CD8+T 细胞OX40的表达远快于CD4+T 细胞。此外，其他一些因素会影响CD8+T 细胞对OX40 的反应，如某些病毒（如流感病毒、疱疹性口炎病毒和巨细胞病毒）造成的幼稚CD8+ T 细胞的早期诱导不依赖OX40[15]，相反，牛痘病毒引起的CD8+ T 细胞反应对OX40 有很强的依赖性[16]。造成这种差别的原因尚不清楚，但推测有可能是炎性细胞因子的产生提供了相似的信号形成了不需要OX40 的旁路。体内注射OX40 激活抗体的研究提出了促进CD8+T 细胞诱导活化的深层机制，即通过增强CD4+T 辅助细胞的活性[17]。在幼稚CD4+ T 细胞中，OX40 信号活化会通过细胞早期自分泌IL-4 有限导致T 辅助细胞2（Th2）生成[18]。然而，抗原和IL-12信号能够克服这种活性，使得OX40 也能够促进Th1 细胞反应[19]。尽管调节细胞因子的生成是OX40 共刺激信号的重要的活性机制，但是，由于T 细胞或非T 细胞受到其他天然信号的作用仍能产类似的细胞因子，如IL-4、IL-12 和IL-6，能够使T 细胞强烈分化成不同的细胞系，因而，OX40 调节T 细胞分化和存活的机制是否主要就是由这些因子产生的就显得比较有争议。

　　2 OX40 对天然Treg 和诱导型Treg 主要发挥抑制作用

　　最早通过转录本分析发现天然CD4+CD25+调节性T 细胞表达OX40，随后通过细胞表面染色得到进一步确认[20]。一项通过Foxp3 GFP 转基因小鼠的研究证明，OX40 在天然Treg细胞和诱导型Treg 细胞上均高表达[21]。与OX40 对T 效应细胞的协同刺激作用相反，OX40对Foxp3+ Treg 细胞产生很强的负调节作用。应用OX40 激活型抗体或OX40L 过表达APC细胞刺激CD4+Foxp3+ Treg 细胞上的OX40，在体外能够持久的消除它们的抑制活性。这种由OX40 共刺激导致的抑制功能的丧失，并不是由于Foxp3+Treg 细胞的增殖发生改变或者细胞死亡，而是似乎与Foxp3 基因表达受到抑制有关。此外，效应T 细胞受到OX40 共刺激后会完全抑制活化的T 效应细胞诱导生成新的Foxp3+ Treg 细胞[22]。因此，OX40 对T 细胞的影响可能并不仅仅是通过刺激效应T 细胞，还有可能是通过抑制调节性T 细胞。OX40可能控制了抗原特异性Treg 细胞在外周被诱导的重要节点而发挥作用。除了OX40 之外，还有很多调节Foxp3+ Treg 细胞抑制功能的细胞表面分子[23]，OX40 与它们相比具有以下特殊性：

　　OX40 对于天然Foxp3+ Treg 细胞的起源和功能是非必须的。OX40 缺陷小鼠的天然Foxp3+ Treg 无论在表型或是功能上都正常，而CD28 或IL-2/IL-2R 任一种因子基因缺陷都会导致Foxp3+ Treg 细胞数量减少或者功能降低。应当注意的是OX40 和CD28 对于诱导活化的效应T 细胞生成新的 Foxp3+ Treg 细胞的作用是完全相反的。如果缺少CD28 共刺激，只会有很少的效应T 细胞转化为Foxp3+ Tregs [24]，与之相反，OX40 主要抑制Foxp3+ Treg细胞的诱导生成。

　　天然 Treg 细胞上的TNFR 家族结合配体后，也会清除细胞的抑制活性，这与Foxp3+ Treg细胞的大量增殖后凋亡有关。有研究显示，TNFR 介导的Treg 细胞功能的丧失与刺激效应T细胞有关，而不是对Treg 的直接刺激[25]。这提示，OX40 并不影响Foxp3+Treg 细胞的发育和增殖，而是抑制Foxp3 基因转录而发挥作用。

　　OX40 和CTLA-4 对Foxp3+ Treg 细胞的调节机制也有很大差别。最明显的差异就是CTLA-4 缺陷小鼠很容易发生多器官自身免疫并于4 周左右死亡，而OX40 缺陷小鼠体质健康并不发生任何明显的自身免疫疾病[26]。此外，封闭CTLA-4 不利于Foxp3+ Treg 细胞的抑制功能，而Foxp3+ Treg 细胞上的OX40 缺陷并不会干扰它们的抑制功能。这些差别引发人们对于以OX40 为标靶的，Treg 细胞介导的免疫调节治疗的优越性的极大兴趣。

　　这些研究结果仍不能清楚的解释OX40 是通过什么额外途径促进外周效应细胞反应的。OX40 能够直接作用在效应T细胞上以支持它们的增殖和生存；OX40 也间接地通过抑制Treg细胞介导的效应T 细胞抑制作用和通过阻滞从活化的效应T 细胞库中生成诱导型Treg 细胞发挥作用。因此，OX40 对效应细胞的共刺激效应十分显著。这有助于解释为何阻滞了OX40的共刺激能够显著地防止非CD28/CD154-依赖的排斥反应。

　　3 OX40 促进记忆性T 细胞的生成

　　记忆性 T 细胞是免疫系统中重要的细胞型，对于对抗抗原侵袭产生保护性免疫有重要的作用，但同时对于移植排斥有不利的影响，它们很容易进攻移植物，使得移植物在移植后受损失去功能甚至完全损坏[27]。由于记忆性T 细胞不像幼稚T 细胞那样容易检验，记忆性T 细胞在诱导移植耐受方面越来越引起人们的关注。一直以来，效应T 细胞成为记忆性T细胞的能力似乎在T 细胞激活的初始阶段无迹可寻。有研究表明，T 细胞共刺激分子，包括OX40，可能对记忆性T 细胞产生过程的重要节点发挥调节作用[28]。事实上大多数共刺激分子都能通过T 细胞激活诱导产生，也正是因此，它们在效应T 细胞/记忆性T 细胞转化阶段对免疫反应扮演了重要的角色，而在T 细胞激活的初始阶段作用不明显。有研究表明，OX40 在产生免疫记忆唤醒中有特殊重要的作用[29]。尽管OX40 促进记忆反应的确切机制还不明确，但这可能与OX40 共刺激信号存在时细胞生存基因的持续表达有关[30]。有学者应用T 细胞增殖稳态模型进行研究发现记忆性T 细胞表面持续表达OX40，并且OX40 共刺激信号对于记忆性T 细胞行使移植物排斥作用具有不可或缺的意义。阻滞OX40 并不能阻止记忆性T 细胞的产生，但是如果记忆性T 细胞生成时缺乏OX40 信号，会导致功能缺陷，在再次受到刺激时不能产生高水平的干扰素γ。有证据表明，记忆性T 细胞在排斥反应中的再次激活需要OX40 参与[31]。在抗原预先致敏的供体小鼠，如果同时阻断OX40/OX40L 途径与CD28 信号途径，心脏移植物的存活时间明显延长。尽管这些研究结果对于临床应用有很重要的意义，但研究者尚不能确切的解释OX40 是如何与其他共刺激信号途径发生相互作用，协同促进记忆性T 细胞产生的。越来越多的研究正在不断探索揭示这些现象内在的机制，这些研究对未来以记忆性T 细胞为标靶的移植排斥的临床治疗提供了有益的信息和基础。

　　4 结论

　　OX40/OX40L 在免疫应答过程中提供重要的共刺激信号，在器官移植术后的宿主抗移植物反应中发挥着重要作用。增强OX40 信号可以促进CD4+T 细胞的增殖，抑制CD4+Foxp3+T调节细胞Foxp3 的表达，促进CD4+Foxp3+T 调节细胞凋亡，减少诱导型CD4+Foxp3+T 调节细胞的生成，促进记忆性T 细胞的产生并促进其再次激活。进一步的研究OX40/OX40L共刺激通路的具体作用机制，对未来在器官移植中以CD4+Foxp3+T 调节细胞和记忆性T 细胞为标靶的的诱导免疫耐受提供帮助。

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