筛选棉花抗黄萎病相关基因Ve候选克隆及分析

杨硕，王省芬，马峙英＊，张桂寅

河北省作物种质资源重点实验室，河北农业大学，河北保定（071001）

E-mail：mzhy@hebau.edu.cn

摘要：根据番茄中已克隆出的抗黄萎病Ve基因在NCBI上Blast比对结果，设计一对特异性引物，扩增出棉花的一段EST。本试验采用混合池PCR方法，对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选，最终从110,976个BAC克隆中筛选到含有Ve基因片段的3个阳性克隆，分别为277J9、277K7和277K8。用Sau3AI对其中的277K7克隆进行酶切，构建亚克隆文库，并用特异性引物继续筛选为克隆Ve基因奠定了基础。研究表明，混合池PCR法对克隆数目巨大的基因组文库的筛选很有效。

关键词：棉花；黄萎病；BAC文库；Ve基因；混合池PCR

中图分类号：S562.032

1.引言

黄萎病（Verticillium wilt）是一种由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和黑白轮枝菌（Verticillium albo-atrum）引起的土传维管束病害，在世界各地引起许多重要经济作物如陆地棉（Gossypium hirsutum）、茄子（Solanum melongena）、番茄(Lycopersicon esculentum)、马铃薯（Solanum tuberosum）和甘蓝（Brassica chinensis）等发生黄萎病[1-5]，严重影响了这些作物的产量和品质，至今尚未从根本上解决，因此，挖掘植物抗黄萎病相关基因并将之应用于育种可能是解决上述问题的有效途径。

目前，关于棉花等植物抗黄萎病基因定位和抗病基因克隆的报道很少。在番茄中，Kawchuk等[6-8]分离到抗黄萎病基因家族的2个成员基因Ve1和Ve2，将之转化马铃薯后，成功提高了马铃薯抗黑白轮枝菌的能力。BAC文库是分析、分离特定基因表达的有利工具，其大片段DNA包括了编码区、内含子和区[9]。本研究根据番茄中Ve1基因在NCBI

上的Blast比对结果，设计一对特异性引物，扩增棉花的一段EST，采用混合池PCR技术筛选课题组构建的抗病优质海岛棉品种Pima90-53 BAC文库，以获得含有抗黄萎病Ve基因的BAC克隆，为进一步克隆抗黄萎病Ve基因奠定重要基础。

2.材料与方法

2.1 供试材料

海岛棉品种Pima90-53及其BAC文库均来自河北农业大学棉花遗传育种研究室，感受态细胞大肠杆菌DH5α和克隆载体pUC118BamHI/BAP分别为天为时代公司和TaKaRa公司产品。

2.2 试验方法

2.2.1 EST序列的获得和特异引物设计

根据番茄中已克隆的抗黄萎病Ve1基因在NCBI上BLAST比对结果，设计一对特异性引物，序列分别为：CESTF：5＇----GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA---3＇；CESTR：

本课题得到国家973项目（2004CB117302-1）、国家自然科学基金（30270848）、教育部重点科技项目（204017）的资助。

5＇---CACTTCTGGTATTGGCCC---3＇。以50ng海岛棉品种Pima90-53基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增反应总体积为20uL，包括：10×PCR buffer(含Mg2+) 2.0µL，2.5mM dNTP 1.6µL，Taq酶(2.5U/µl) 0.2µL，正向引物(10uM) 1µL，反向引物(10uM) 1µL，模板DNA 1µL，用ddH2O补至20µL。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min，5个循环；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 1min，25个循环；72℃延伸10min。回收PCR产物后，用pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)试剂盒克隆，克隆经上海生工生物工程有限公司测序后， NCBI比对，以获得与Ve同源的棉花EST。

2.2.2 BAC文库的筛选

采用碱裂解法[9]提取Pima90-53 BAC文库110,976个克隆的质粒DNA。为减少PCR筛选工作量，在Shuichi等[10]的筛选方法基础上进行了改进，首先将一个384孔板中的所有克隆作为一个整体混合，即构建一级池，用引物(CESTF，CESTR)逐级进行PCR筛选，然后对出现目的片段的阳性一级池横行作为一个整体混合，即构建二级池，最后筛选阳性混合行的单克隆，获得阳性单克隆。PCR体系和程序同上。

2.2.3 阳性克隆的分析

对筛选到的阳性BAC克隆用性内切酶Not I酶切，脉冲场电泳检测插入片段大小，并用Eco RI对克隆进行完全酶切，确定三个克隆之间的重叠关系。

2.2.4 BAC亚克隆的构建和筛选

采用性内切酶Sau3AI局部消化法构建目标BAC的亚克隆文库[11]。用碱裂解法提取BAC亚克隆文库3块384孔板共1152个克隆的质粒DNA，筛选方法、引物、PCR体系及程序同上。

3.材料与方法

3.1 EST序列的获得

根据番茄中已克隆出的抗黄萎病Ve1基因在NCBI上BLAST比对结果，设计一对特异性引物，从海岛棉品种Pima90-53基因组DNA扩增出一条EST（图1），用Blast2.0比对，发现同Ve1基因氨基酸同源性很高为55%，推测其为抗黄萎病Ve1基因的一部分。

3.2 海岛棉品种Pima90-53 BAC文库的筛选

利用上述获得的EST序列，采用特异性引物CESTF和CESTR筛选一级池，发现在384孔板的板277出现目的片段。通过逐级筛选，最终获得三个阳性BAC克隆，分别为：277J9、277K7和277K8，筛选过程如图2所示。

1 GAATTCACTAGTGATTGGAGTATCCCTGAGTCGATATGCAAAAGTTCATATCTTCAAGTA 60

61 CTTGATTTGTCTAATAATTCCCTGAGCGGGTCTATTCCTGAATGCCTGATTCAGATGAGT 120

121 GTGTCTCTTGGAGTACTGAATCTAAGGAGAAACAATCTTACTGGCAACATTTCTGACACA 180 181 TTTCCAGAGAACTGTTTACTACAAACTCTAGTTCTCAATCGAAACTTACTGCGAGGAAAG 240 241 GTTCCAAAATCCTTGGTCAGTTGCAAAATGCTGGAGGTTCTAGACCTCGGAAACAATCAG 300 301 ATCAATGATACATTCCCATGCCATTTGAAGAATATATCCAGCTTGCGTGTCCTTGTTTTA 360 361 CGAGGCAATAAATTTAATGGGAACGTGCATTGTTCAGAGAGGAGCCCTTGGCCTATGCTT 420 421 CAGATTGTCGACTTATCTTCAAACAGTTTCAGTGGTAGACTGCATGAAGCATGCTTGTCG 480 481 ACCTGGAAGGCAATGCGAGCTGCTGAAAGTGAAACTCTATCAGAGCTCAACCATCTCCAA 540 541 TTTAAAGTTCTAAAGTTAAATTAATTTTATTACCAGGATGCCATAACAGTTACCATGAAA 600 601 GGTTTAGAGTTAGAGCTGCTGAAGATCCTAACGGTGTTTACCTCCATTGACATTTCACGC 660 661 AACAATTTTGAAGGGCCAATACCAGAAGTGAATCGAAT 6

图1 EST核酸序列

Fig 1. The nucleotide sequence and of EST

图2 含有EST的BAC克隆筛选

Fig.2 The protocol for BAC clone screening with EST

3.3 阳性BAC 克隆分析

将筛选到的3个阳性BAC 克隆提取质粒DNA 后，用Not I 进行酶切，经脉冲场电泳检测，3个阳性克隆的插入片段分别为：130kb （277J9）、120kb （277K7）和125kb （277K8）。再用Eco RI 对3个阳性克隆进行完全酶切，根据PCR 检测目的片段条带的强弱及Eco RI 完全酶切后的带型，选择277K7构建亚克隆文库（图3）。

图3 NotI 酶切(左)和EcoRI 酶切(右)的电泳结果

1.阳性克隆277J9；

2.阳性克隆277K7；

3.阳性克隆277K8。

Fig.3 Digestion results with NotI (L)和EcoRI (R)

Positive clone 277J9；2. Positive clone 277K7；3. Positive clone 277K8。

3.4 目标BAC 克隆的亚克隆文库构建

以特定时间（90min ）改变酶用量（0.18-0.30U ）对质粒DNA 进行部分酶切，电泳结果表明：性内切酶Sau 3AI 的用量在0.22-0.26U 之间，酶切后的大部分DNA 集中在2~4kb 。利用0.24U 的内切酶Sau 3AI 对质粒DNA 进行大量酶切，回收目的DNA 片段。载体和插入片段DNA 的连接比例直接影响连接产物的转化效率。本试验采用1∶5的载体和插入片段DNA 摩尔比梯度，而且重组率也很高，产生的非重组体比较少。构建了BAC 克隆277K7的亚克隆文库，该文库共含有1152个克隆。

4. 讨论

本研究根据番茄中已克隆出的抗黄萎病Ve 基因在NCBI 上BLAST 比对结果设计特异性引物，采用混合池PCR 方法筛选棉花BAC 文库中获得含有抗黄萎病Ve 基因的BAC 克隆，为进一步克隆抗黄萎病Ve 基因奠定了重要基础。开展测序工作的前提关键技术即建立亚克隆文库[12]。本研究构建的亚克隆文库含有1152个克隆，覆盖整个BAC 的19.5倍。该亚克隆文库的构建为获得抗黄萎病Ve 基因的完整序列、开发与抗黄萎病相关的SSR 标记提供了重要的基础资源。

利用混合池PCR

筛选文库，具有快速高效、灵敏度高、不需放射性标记以及假阳性低1 2

3 M 1 2 3 145.5kb 97.0kb 48.5kb

A．特异性引物的设计，该技术对于特异性引物的设计质量要求很高，筛选时首先可根据已知EST片段的特异性和获得全长序列信息作为参考，来确定设计的特异性引物是否可用。为了保证扩增片段的特异性和获得全长序列，对于一个基因家族，应避免在序列的保守区设计引物，否则会获得多个不同的序列。

B．BAC文库质量，由于技术问题可能BAC文库中只有部分目标序列是完整的，因此要从文库中将全长基因分离出来的难度比较大，在未知目标基因全长序列的确切长度的情况下，只能先分离出其中含目的片段的克隆。然后再亚克隆，筛选亚克隆测序。

本研究证明用混合池PCR法筛选大数目克隆的基因组文库是切实可行的。

参考文献

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YANG Shuo, WANG Xingfen, MA Zhiying, ZHANG Guiyin

Key Laboratory of Crop Germplasm Resources of Hebei Province, Agricultural University of

Hebei, Baoding, Hebei (071001)

Abstract

A pair of specific primers was design based on Ve Gene and used to perform PCR with gDNA from the Sea Island cotton Pima90-53, with good quality and high Verticillium wilt resistance. A clone (EST) characterization of the Ve homologue Gene was obtained by sequencing analysis. A method based on polymerase chain reaction (PCR) for screening BAC library was described. The theoretical consideration of the particularly powerful. Using a pooled PCR screening procedure, three positive BAC clones, 277J9、277K7 and 277K8,were detected from 110,976 BAC clones. The BAC clone 277K7 was used for construction and screening of a sub-clone library. The sub-clone library could be used for obtaining the complete sequence of Verticillium Wilt Resistance Gene. The results indicate that the pooled PCR method is effective for screening of genomic libraries having large number of clones.

Keywords: Cotton; Verticillium wilt; BAC library; Ve Gene; Pooled PCR screening