酿酒酵母的分离纯化实验

学院：轻纺与食品学院    专业：轻工生物技术    姓名：王克寒    学号：0943095015

一、实验目的

1.学习和掌握对酿酒酵母的纯种分离和纯化的原理和方法。

2.了解工业上酿酒酵母的菌种保存、活化及复壮工 艺。

传代培养中的细胞传代培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养。

已经纯化的用于工业生产的菌种经过传代的培养和冷冻保存，由于环境因素或自身原因，使细胞内的DNA结构发生改变，或感染杂菌，会出现生长缓慢、对环境和杂茵的抵抗力减弱等现象。我们需要不断对出现这种衰退或还未出现衰退的菌种进行复壮分离纯化，使其中未衰退的个体大量繁殖，从而形成纯种的菌群。

血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面刻有两小方格网，每个方格网分为9个大方格，中间的大方格就是计数室，计数室的容积为0.1mm3。计数时，能常数5个中方格的总菌数，然后求平均值，再乘上计数室中方格数就可以得到计数室中的总菌数，然后就可以换算成1mL菌液中的总菌数。

酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，细胞为球形或卵形，繁殖方法为出芽生殖，是一种真核生物，最适生长温度为25℃~30℃。

1.菌种：酿酒酵母

2.实验试剂和药品：麦芽汁培养基粉末、蒸馏水

1.实验准备

1）将12支大试管、两个三角瓶、6支1mL吸量管、涂布器洗干净烘干，将玻璃珠装入一个三角瓶铺满瓶底。

2）制做棉塞塞紧大试管管口和三角瓶瓶口，用棉丝插入吸量管做滤菌之用，用报纸将大试管、三角瓶、涂布器、平板培养皿包扎好，干热灭菌。

3）用麦芽汁培养基粉未配制培养基，取6支干热灭菌的大试管，每一支都用分装器装入5mL左右培养基，其余的装入空的三角瓶。取另外6支大试管和装有玻璃珠的三角瓶装入蒸馏水，大试管每支装9mL，三角瓶只需铺满盖过玻璃珠。将试管和三角瓶进行湿热灭菌。

4）将6支装有培养基湿热灭菌的大试管摆斜面。

2.实验操作

以下所有操作均为无菌操作

1）用接种环挑取酵母菌培养物2~3环放入装有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡20分钟将菌体打散。

2）用三角瓶中打散的菌液进行简单制片，放在显微镜下观察，确认菌体是否已经打散，并估计菌液中菌体的浓度。

3）用吸量管吸取三角瓶中的菌液1mL转入装有9mL无菌水的大试管中，充分震荡，制成10倍稀释液并标记10-1，依次以此方法配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液，并用记号笔记好。

4）用血球计数板计数各稀释液中每mL细菌个数，选取每毫升30~60菌体的稀释浓度。

5）吸取不超过1mL浓度合适的菌液于六个平板上。

6）加热融化三角瓶中的培状基，待冷却到50℃后倒入平板摇匀冷却凝固。

7）将六个平板用报纸包扎好倒置于30℃的培养箱中12h~24h。

8）观察平板中菌落的生长状况，取丰满色白有光泽中等偏大，向突起但中心有微小凹陷的菌落20~30个，用接种环挑起接种到斜面培养基上，30℃的培养箱中12h~24h。

9）将斜面中的菌落进行简单制片，放在显微镜下观察，看斜面培养物是否为纯培养。

指导老师：黄