谷氨酸棒状杆菌发酵色氨酸的工艺研究

谷氨酸棒状杆菌发酵色氨酸的工艺研究

郑蕾 1.2 周守标1

（1.安徽师范大学生命科学学院，2.芜湖职业技术学院，安徽芜湖 241000）

摘要：为了优化发酵工艺，提高色氨酸产量，本文对发酵培养基的碳氮源、发酵条件、及小试发酵过程控制进行了实验研究。结果表明，最佳发酵培养基为葡萄糖4g/L、胰蛋白胨20g/L，色氨酸产量达0.43g/L；在摇瓶发酵的基础上，进一步在50L发酵罐中进行小试表明，在发酵温度36℃、pH7.0、搅拌速率700r/min的条件下，色氨酸产量达0.45g/L。

关键词：谷氨酸棒状杆菌，L-色氨酸，发酵工艺

中图分类号：文献标识码：A；文章编号：1009-1114（2010）03-0045-03

A Study on Fermentation technology of tryptophan production by Corynebactenum glutamicum

ZHENG Lei & ZHOU Shou-biao

Abstract：In order to improve the yield of L-tryptophan , the fermentation medium and process control were investigated in the paper. The results show that the best carbon and nitrogen source were glucose and pancreas peptone at 4g/L and 20g/L, respectively, the tryptophan yield was 0.43g/L. The scale-up of fermentation from shaking flask to 50 L fermenter for based on the results of shake flask fermentation was studied, In the optimal condition, the tryptophan yield

were 0.45g/L at 36℃, pH7.0, and the agitation rate700r/min respectively.

Keywords：Corynebactenum glutamicum，L-tryptophan; Fermentation technology

收稿日期：2010-05-11

作者简介：郑蕾，女，1980年出生，安徽芜湖人，安徽师范大学生命科学学院在职研究生，讲师.

L-色氨酸是必不可少的芳香族氨基酸，拥有独特的吲哚侧链，使得它成为大脑中大量神经递质的前体物，像血清素，褪黑激素，烟酸等，它们对于调节食欲、睡眠、情绪和疼痛感是必不可少的[1,2]。早期主要采用化学合成法和蛋白质水解法来生产色氨酸，随着国内外市场对色氨酸日益增加的需求，工业上逐渐开始用微生物来发酵生产色氨酸[3,4]。

微生物法可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。发酵法生产色氨酸是世界性难题，其产量难以满足需要。目前国内尚无生产色氨酸的厂家，发酵研究水平也较低[5,6],目前我国在对发酵法生产色氨酸的研究和生产水平方面与世界同行有较大差距。

本文在用北京棒状杆菌发酵生产色氨酸的基础上，对发酵培养基碳氮源的筛选及最佳浓度的确定、发酵条件的优化控制以及补料的影响进行研究；在摇瓶发酵条件已优化的基础上，在50L发酵罐中进行小规模放大培养，在模拟工业化生产的条件下，进一步优化以提高色氨酸的产量。

1. 材料与方法

1.1. 菌种

北京棒状杆菌：安徽师范大学生命科学学院实验室保藏

1.2. 仪器与药品

BS-IEA振荡培养箱，国华电器有限公司；50L发酵罐，江苏吴中生物工程设备有限公司；可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；净化工作台，苏州净化设备有限公司葡萄糖、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母浸出粉、生物素、硫酸铵、维生素B1盐酸盐、盐酸四环素、KH2PO4，中国医药（集团）上海化学试剂公司

1.3. 实验方法

1.3.1. 发酵培养基

葡萄糖：4g/L、K2HPO4：5.6g/L、胰蛋白胨：1 g/L、硫酸铵：1.6 g/L、硫酸镁：0.8 g/L、二水合柠檬酸三钠：1.6 g/L、七水合硫酸亚铁：2.8mg/L、硫酸锰：1.2 mg/L、生物素：0.3 mg/L、维生素B1盐酸盐：1.3 mg/L.

1.3.

2. 种子培养方法

将装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中分别接入1环生长良好的斜面培养物，于30℃、转速为 160r/min下培养24h。

1.3.3. 发酵罐发酵方法

按装液量为65％，接入2％的种子，于30℃，搅拌转速为300r/min、通风量为1vvm的条件下发酵48h（溶氧、温度、pH值自动显示）。

1.4 . 分析方法

色氨酸测定（标准曲线法）[7,8],用蒸馏水将色氨酸储备

郑 蕾 周守标：谷氨酸棒状杆菌发酵色氨酸的工艺研究

液稀释至20、40、60、80、100μg/mL ，将各试管用对二甲氨基苯甲醛储备液定容至10ml ，在快速混匀器上混匀后，在沸水浴中加热2min 后，向各试管中各加亚钠溶液一滴，再继续加热3min ，冷却，在600nm 波长测定吸光度，以色氨酸浓度为横坐标，以相应的吸光值为纵坐标，用Excel 软件绘制色氨酸标准曲线。

2 结果与分析

2.1. L-色氨酸标准曲线的绘制

采用标准曲线法测定色氨酸含量实验结果如表图1，从图1可知R 2=0.9971，线性回归较好，说明采用该方法较可靠。

00.050.10.150.20.250.30.350.40.450

20

40

60

80

100

120

色氨酸浓度ug/mL

吸光度A

图1 L-色氨酸浓度与吸光度的线性关系

2.2. 葡萄糖浓度的影响

研究葡萄糖浓度对色氨酸生产方面的影响，经过24h 的发酵，其结果如图2。可以看出，当葡萄糖浓度为4g/L 时，色氨酸产量最高。当葡萄糖浓度小于4g/L 时，可能由于培养基中的葡萄糖只够用于前期的菌体生长和色氨酸合成，当葡萄糖消耗完以后，菌体无法产酸，以致色氨酸产量不高。但当葡萄糖浓度大于4g/L 时，可能由于基质较丰富，使菌体开始生长旺盛，造成发酵液粘稠，传质较差，以致影响产物合成。

2402452502552602650

2

4

6

8

10

葡萄糖浓度（g/L ）

色氨酸浓度（m g /L ）

图2 葡萄糖浓度对吸光度的影响

2.3.氮源的影响

基于不同的氮源对微生物的生长及产物的合成都有影响，实验中分别对蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉这三种氮

源对色氨酸产量的影响进行了研究。结果如图3，从图中可以明显看出胰蛋白胨的效果远远大于蛋白胨和酵母浸出粉，这可能是由于胰蛋白胨中含有的一些成分，更能促进细胞生长及产物合成，所以胰蛋白胨为最佳氮源。

50100150200250300350400450500

蛋白胨

胰蛋白胨

酵母浸出粉

色氨酸浓度（m g /L ）

图3 不同氮源对色氨酸产量的影响

2.4. 氮源浓度的影响

从下图可以看出，当胰蛋白胨浓度为20g/L 时，吸光度达最大，相对应的色氨酸产量也最高。本实验步骤设计的有点欠缺，因为图中曲线并没有明显上升和下滑的趋势，尤其是当浓度为20g/L 和25g/L 时，吸光度相差不大，也有可能在大于25g/L 的浓度中，曲线还会上升。应把浓度设计到40g/L ，这样得出的结果会更有说服力，但由于时间和菌种原因，没有具体去做，就按本实验中的结果确定培养基中的最适氮源浓度为20g/L 。

050100150200250300350400

5

10

15

20

25

30

胰蛋白胨浓度（g/L ）

色氨酸浓度（m g /L ）

图4 胰蛋白胨浓度对色氨酸产量的影响

2.5. 50L 发酵罐中发酵色氨酸

在确定摇瓶发酵最优条件的基础上，在50L 三联发酵罐进行小规模扩大生产试验。随着发酵过程的进行，发酵液中色氨酸含量的变化如图5所示，从图5可以看出，在发酵的开始阶段，色氨酸浓度迅速增加，这是因为在起始阶段，发酵培养基中的营养比较丰富，生产菌大量繁殖，且生长代谢旺盛，由于色氨酸的合成是生长关联型的，所以其产量在开始时增加较快。在发酵24h 以后，色氨酸的浓度基本趋于平衡，

这主要是因为培养基中的基质几乎被消耗完，没有营养物质供应菌体产酸，且此时菌体处于稳定期或衰退期，生长代谢缓慢，甚至部分菌体死亡，所以色氨酸的产量只有微量增加。

3. 结论

本实验是通过对北京棒状杆菌生产色氨酸的研究，确定了该菌株生长和产酸最适宜的氮源是胰蛋白胨，其最佳浓度为20g/L，对于氮源的筛选及浓度确定在以前的研究中较少见。发酵培养基中最佳葡萄糖浓度分别为4g/L，这与以前报道的用5%、8 g/L、20 g/L等的葡萄糖浓度相比，减少了葡萄糖用量，节约了原料成本，使得本实验中得出的结果更有利于工业化生产。在50L的发酵罐中进行小规模扩大生产，发酵条件控制在温度36℃、PH7.0、搅拌速率N 700r/min−1、经过48h的发酵，色氨酸产量最高达0.45g/L。

文稿责编 张玮

参考文献

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[2] Pınar Kocabas,Pınar Calık,Tuncer H. Ozdamar. Fermentation characteristics of L-tryptophan

production by thermoacidophilic Bacillus acidocaldarius in a defined medium[J]. Enzyme and

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科学版) ，2004，26(6):68-73

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研究[J].食品与发酵工业.2007，33(7):37-40

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