利用不同的方法筛选和鉴定转化子方案设计

一、实验材料

1、Pet32-CaM5质粒

2、LB液体培养基：胰蛋白胨3g；酵母提取液1.5g‘NaCl 3g；蒸馏水300ml

3、PCR反应配料： dNTP mixture    前向引物 (P1)   反向引物  (P2)  DNA 模板         rTaq酶  灭菌蒸馏水  6或10 x loading buffer

4质粒DNA提取的试剂

   溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM 

                Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L；

    溶液II：NaOH溶液（内含1% SDS）：0.2 M；

    溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL

                 冰醋酸，28.5 mL H2O；

    饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）

    氯仿

    TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）: 20 µg/ml

    醋酸铵（pH7.5～8.0）: 7.5 mol/L

    异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。

二、实验流程与步骤

1转化子的筛选(主要增加蓝白斑筛选)

（1）LB培养基的配备

（2）向LB培养基中加入X-gal和IPTG

（3）复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，37℃导致培养12-16h

（4）出现白色菌落则是转化子

2菌落的直接PCR

(1)准备好新的含有Amp筛选培养基和PCR反应管。分别对应编号1-6

(2)在培养基上面无菌牙签无菌挑取6个白色单菌落

(3)每个菌落分作两份，分别涂在相应编号的培养基和PCR反应管中

(4)接种菌落的筛选培养基，置37℃过夜培养后保存在4℃冰箱

(5)向6支PCR反应管中加入PCR反应混合液，进行PCR反应

反应混合液成分：                PCR反应过程

10 x PCR buffer      5μl                 

dNTP mixture        4μl                 94℃   2 min

前向引物 (P1)       2μl                94 ℃  30sec

反向引物  (P2)      2μl                62 ℃  30sec

DNA 模板          1μl                72 ℃  30sec

rTaq酶             0.5μl               72 ℃  5 min

灭菌蒸馏水         35.5μl

(6)电泳观察：反应结束后，取5μl PCR产品，加入1μl  6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。

3、重组质粒大小的鉴定

(1) 用无菌牙签从第2步新的筛选培养基中挑取PCR反应阳性的菌落（指PCR反应电泳后条带复合要求的相应菌落）

（2）将菌落接种于含Amp 50μL/mL的LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h。

（3）提取质粒DNA，直接电泳，与pGEM-T作对照

提取质粒的步骤

1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。

2) 离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液）

3) 加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。

4) 加入200 µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。

5) 加入150 µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。

6) 离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。

7) 向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。

8) 移取上层水相溶液（约450µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。

9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。

10) 离心(14 000rpm，10min，4℃)，倒掉上清液。

11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5min，倒掉上清液。

12)真空抽干或室温自然干燥

13）加30~40µL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用

※电泳条件120V，25min

4重组质粒的酶切鉴定

酶切反应液的配制:

                   HindⅢ                1μl

                   10×M buffer            2μl

                   DNA                  5μl

                   ddH2O                12μl                   

  酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。

电泳检测

  反应结束后，向反应液中加入2.2μl  10×loading buffer，混匀以停止酶切反应，所有22.2μl样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,45min左右。

若出现613bp和219bp电泳条带的质粒，则可认定为成功导入了重组质粒的菌株。