国家自然科学基金标书写作全攻略 成功范例 份

指导思想篇

1、追求卓越，在知识上要绝对专业，坚决反对侥幸心理。

2、相信NSFC申请是公平的，大家靠实力竞争，必须花大力气写标书；如果你认为NSFC 只有关系，你就不用继续往下看了。

3、NSFC是一个系统工程，需要花很多时间和精力，而不仅仅是几页标书，是智慧沉淀的

结晶。

4、不要把NSFC看的高不可及，你要相信自己的创意，哪怕你只是一名一年级硕士

5、机会主义是有的，但我们没有什麽其它的资本，只能消灭标书里一切可能的失败因素，

加上完美的选题和课题设计，彻底征服评委，不给评委任何黑掉你的机会。

6、基金申请不同于实际研究课题设计，必须把个人兴趣与NSFC兴趣结合一致，投其所好。

选题立项篇

1、基金成败关键还是选题要好，提前半年，刚入行的提前一年进行课题搜索

2、老板指定的题未必是好题，最好自己选题，如何立项应该是研究生学习最重要的一课，

毕业后你会发现，没有人会指点你什麽课题有价值了，在中国学术的沙漠里，只剩下你自己了。

3、好课题是对学科深刻理解的条件下产生的，大量翻阅文献吧，汲取知识的同时千万别忘

了思考，你发现别人存在漏洞的时候，好课题就离你不远了。

4、选题最好以问题为导向，不要以技术为导向，找到问题了，课题就找到了。而拿着新技

术去找能解决的问题，效果多数不好，但还是大有人在，比如RNAi。

5、思想，发散思维，多方法多学科交叉，一般都会比较受人青睐，容易申请到基金，

但不能为了交叉而强行交叉。

6、创新性新技术、新理论的课题要有一定的理论与技术基础，最好有工作基础，没有你也要东拼西凑，这是在中国，NSFC似乎讨厌空中楼阁

7、临床课题研究最好别选临床应用方向，而选应用基础研究。

8、选择自己熟悉，有工作基础的领域，别跨越太远。你是在谝钱，记住了，你不装的象个

行家，NSFC是不会给钱的。

9、重要科学问题的切入点准确，切忌过宽、过大，只要体现一定的新意和研究价值就行了，

能得诺贝尔奖的课题NSFC是不给钱的。

10、没有人做过的课题不能做为立项的依据，但NSFC资助的项目必须是国际上没人做过的，而不是国内空白。当然，如果国际上有同类结果，你不说，地球上的中国人也许也不知

道，但一旦被识破，你死定了。

11、如果是捕捉科研前沿性的课题，最好设计周密，尤其是目的和结果的一致性、可获得

性和可预期性，通过课题实施所获得的结果必须能充分支持与研究目标相一致的结论。

12、热点课题不一定是好课题，热点上的人也很热。但在还没热起来的热点，一定是一个

好课题，标书评审滞后半年呢，比如最开始的一批SARS课题。有时也不防设计一些非热点

但是对与科研有价值的课题，发挥出奇不意的效果。

13、临床课题可以是当前没有好办法治疗的疾病，急需解决的临床问题，而在国际上检索

的文献只有几篇的那种。

14、本人不主张以最新的重量级文献做指导，你会发现，很多人跟你的想法惊人的一致。

有人特别反对跟风。

15、一定要到NSFC检索一下类似课题的历年资助情况，太多、太少都不好。最好是最近

二年逐渐增加的资助领域。

立题依据篇

1、题目要有新意，吸引人，既要概括主题，容易懂，又要有些少见的新词或缩写，调胃口。

2、5000字左右，最多两页，不包括文献，行距字体大小适中。

3、国内外研究现状及分析一定要准确，甚至是中庸，绝不能偏激，不然不同意你的专家会

带着逆反心理看你的标书，你死定了。

4、课题研究的具体问题和研究意义，则必须说的声泪俱下。应该达到的境界是：连你自己都认为这个课题不做就没有天理，尽管这个课题其实只是一堆屎，呵呵。当然如果有实力，

可以解决关键的科学性问题，那再好不过。然而课题意义不是最重要的，但常常被撰写得份量过重，课题总体构想、大体实施方案及可能的预期结果才是人们最关心的。

5、要把复杂的事说简单。既要论述充分，写作又要简练，最多两页半（不算文献）。剔除所有不必要的知识细节、理论和概念，要舍得割肉才行。越简单，出错越少，专家不懂的越

少（他们有时确实有知识盲点）。有人主张“要让评委看过之后，感叹您idea的精妙，却不太明白您的理论依据”，我认为在面上项目不太合适，在重点项目还可以。我赞同“写出来

的理论，要让人家能欣赏”。写出来的理论，要让人家看不懂“，这份申请书很危险。

6、立论依据要非常突出：理论性课题一定要有新观点，应用性一定要实用，与现有理论或

方法具有明显的先进性，总之要让人感觉到有意义。

7、一定要有可预见的成果，至少画一张大饼，但看上去要象真的才行。基金委的家伙们是

撒把米就叫你下蛋的，如果你说：“吃完米，明儿再下”，那你就只有饿着了。

8、任何重要的论点都要有文献标注，有文献就等于没有疑问。参考文献要新，最好是当年

的。而且一定要引上Science、Nature、Annual Reviews系列杂志的近期文献，增加自己立论

依据的权威性。最好包括已有工作基础，将已有相关结果以及发表的杂志列上，可以增加可信度。

9、一定多让本实验室的人修改，特别是中过基金的前辈，要改15遍以上才行。请外人修

改时要“防人之心不可无”。

10、标书的评委参差不齐，评审意见也差异悬殊。好的标书最容易受到高水平评委的赏识，

只要你的题好，这些评委是好征服的。难就难在如何让水平差的评委通过你的标书。我认为除了运气好，少碰到一些这样的评委之外，最关键的一点就是让他们看懂你的标书；第二就是标书不能太长，他是看不下去的；第三就是实验设计在不失科学性、先进性的条件下，尽可能简单，千万别让他觉得你比他高很多，那样你死定了。所以一份好的标书是在高水平教

授和低水平教授之间的平衡，写的非常玄妙的标书通常中不了。

11、评审专家通常是本专业的，也可能不是，尤其是交叉学科投递的项目，评审专家未必

对你的研究领域特别熟悉。所以尽可能少引入非常专业的概念，如果不可避免，也要解释清楚。

12、文字写作要有适当的弹性，不能把话说死，留有余地。因为你肯定会碰到不同意你课

题的专家，除非你运气实在好。对于赞同你课题的同行，只需证明你具备完成课题的实力就

行了，这点容易做到。标书的目的其实就是征服对你课题不同意，甚至存在偏见的评审。所

以立题依据的写作实际上就是一种心理诱导过程（哈哈，骗子可能最拿手了），你开始的观点应该处于偏见评委和你真实观点之间，稍偏你一方，处于容忍范围，他不会立即提出反对，下一步再偏一点儿，逐渐下去到最后，他还是没提出反对，你就胜利了，行骗成功！

13、本人不赞同把认为重要的句子字体增粗或下面打点以示关键，但这也许对于一些评委

管用。

研究方案篇

1、研究目标要明确要精，提法要准确、恰当；内容要详细但文字不宜过多，且一定不能写

得太具体。关键的问题要突出，一定要准确，且要有一定难度，但不必写的太具体，否则有

时会出现mission impossible。

2、可行性分析是你说服评委的第二次机会，可按成熟的理论基础（理论上可行）、研究目标在现有技术条件下的可实现性（技术上可行）、本单位现有技术设备实验材料的完备（设

备材料可行）、课题组成员完成课题能力（知识技能上可行）等几方面分层论述。可以找一

家比自己单位强的合作伙伴，把他们的软硬件条件也加进去。

3、创新点要切合实际，又要有所发挥了，但语气要肯定，指出国际国内研究的先进性和创

新性，点明理论和现实意义。

4、研究内容要集中，与研究目标紧密一致，只作支撑课题最关键最必要的内容。不可为多作实验显示劳动量或增加预算而使研究内容过泛

5、实验方案和技术路线合理、可靠、可行，没漏洞是最重要的。思路好，材料独特，方法

独特新颖，会增加获得资助的机会。技术当然是越新越好，但未必需要采用最时髦的研究手段，不能为了技术而研究。

6、研究内容及方案切忌复杂，步骤最好有一流程图。研究方法、技术路线、实验方案不能

太具体化，容易出漏洞。但你必须让评委认为你十分了解实验技术的整个过程，可以尽可能多的应用技术术语和技术缩写，写出主要实验材料和实验过程。

7、技术方法一定是本实验是已经建立的，至少是有相关实验基础，或虚拟的基础。所有关

键技术要有文献出处，最好是自己实验室发表的，有文献就等于没有疑问。如果本单位力量弱，可挂靠较强的研究机构，从而使评审相信你能完成课题。关键实验材料必须已经具备，

或可以获得。这些问题应该附有相应的证据（如MTA）。

预期研究结果

1、预期结果要考虑对基础和实用双重的价值。

2、以发表论文和申请专利结题比较容易。最好突出SCI收录杂志的影响因子，给基金委的专家们觉得，您的实力确实不一般。因为最终结题情况，是基金委专家们最关心的事情，

他们当然愿意把基金支持能发表高水平文章的人。

工作基础篇

1、工作基础是你说服评委的第三次机会。课题科学先进、技术路线新颖合理可行、工作基

础雄厚这三方面表述要紧密联系、前后呼应。

2、一定要有基础。把实验室发表的所有文章搜集起来，找出与你设计课题相关的，只要沾边，都列上。自己最好在研究生一年级就发表综述，如果努力，第二年申请就来得及。如已

发表高水平文章，基金申请基本没问题。文章与课题关系远一些无所谓，最好既相关，又

不同。

3、预实验结果很重要，而且是有硬data的结果，一定附上。但一定要慎重掌握，不要写

的太多，评委会认为你的工作做的差不多了，没必要再申请基金了。只预期你的课题肯定有好的结果就行了。

4、工作基础可以找个较强的合作单位，你就强壮起来了。

5、有针对性地把研究队伍的相关工作经历、论文、成果等展示出来，但相关基金就最好别露富了，呵呵人员组成篇

1、主要成员6-10名，结构合理

高级研究人员（1-2人）

中级研究人员（2-3人）

技术人员及研究生（3-5人）

2、参加人员技术力量的配备要合适，必须保证一定的劳动力。

3、1名高职足够，多了浪费资源，现在NSFC限项很死的，我们的高职资源快耗竭了。

4、中级人员是骨干，但在职的不要太多，1－2名

5、技术员2名左右，很重要呦，这是专业技术保障

6、研究生不能少于2名，这是主要劳力，地球人都知道。但也有人认为而不应将研究生列

为主要人员，这样NSFC会认为人员稳定，富有干劲。

7、成员介绍要紧扣课题的研究内容和技术路线，既注重梯队、比例、技术力量等科研综合实力的展示，又注意与本课题相关

8、最好不加入老先生，除非他是院士，答应给你基金。不过找个好的副高作课题指导，他

的工作就相当于你的了。但恐怕他的基金还申请不过来呢，哪舍得把宝贵的名额给你呀。

个人简历篇

1、申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著

目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务，所有复印件一定要附上，眼见才为实，

别忘了扫描到电子版里去呦，评委看的是那个。

2、申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。完成的可以都列上，没结题的一

定不要写了，基金委不同情富人，何况我们还是装富的人。

3、中级技术职称的推荐信或在职研究生申请项目的导师推荐信一定不要忘了。

4、至于申请名分问题，就不好讲了，仔细研究申报指南吧，一切按常规，世界上就没有奇

迹了，呵呵。

5、个人简历一定有针对性的倾向于课题方向，并与课题中各人的分工相一致。所从事的研究项目可适当给出，但不能过多，保证课题组有充足时间完成基金课题。

经费预算篇

1、要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，

2、人员费：5 %?管理费：5 %雷打不动，人不值钱呀。

3、实验材料费：60-70%必须占大头

4、仪器费<10%，合作费<10％，不要购置5万元以上固定资产及设备了，实验室也别装修了，NSFC舍不得。但如果有超过万元的仪器设备费，会给人研究条件不过硬的印象，基金

委当然希望把钱投到硬件条件好的单位，可以把基金用于刀刃上。

5、了解当年NSFC资助力度，面上项目自由申请经费以此为标准

6、个实验材料开价要合理，不能狮子大开口。实验不够就把要求拉高些，技术先进些，二

十几万很快就能虚拟花光了，很爽！但不能胡来，会死人的。败家要败得冠冕堂皇，呵呵。

摘要写作

1、摘要可能是标书最后写的部分了，但却是评委最先看的部分，很多标书在这一关就倒下了。

2、摘要字数少，但最忌讳写的平淡无奇。要麽钩起评委浓厚的兴趣，要麽激发他万丈怒火，都算胜利。哈哈，当然要努力后者。但遇到对课题有偏见的专家，能做到后者就不错了，至

少他没把你的标书扔一边去。

3、基于以上认识，摘要一定要语气坚定，旗帜鲜明，一反立题依据中的中庸之道。其实语

句的变化不大，知识删除了有弹性的话就是了。

4、摘要字数有限，资源宝贵，惜字如金，因此要特别注意重点突出，讲明现状、课题意义、课题构想和预期结果。

5、防止“头重脚轻”，削减一般性细节描述，多用概括性语句，讲明现状、课题意义、课

题构想和预期结果部分要相互平衡。

学科选口篇

1、申报的方向和学部很重要，往往结果天壤之别。尽量避重就轻，在竞争不很激烈的领域

申请，除非您有充分的把握。

2、投到你老板能量比较集中的学科，是第一选择。

3、仔细研读基金申报指南，洞悉各专业领域倾斜性项目和优先资助方向。

4、仔细分析NSFC历年与你课题相关资助项目在各学科的分布，发现隔年资助或近几年资

助递增的学科，你基本找到钱在哪了。

5、学科交叉鼓励，但尽可能投到你熟悉的学科。如果十分生疏，找个熟悉那学科的人作搭档，不然你会迷路的。

善后工作篇

1、版面调整，清晰，层次分明，使版面简洁、易于阅读

2、坚决消灭错别字

3、完美5遍以上

4、合理行使基金委赋予的权利－回避制度自我保护，注意自己小领域的同行，防止个别在学术道德方面有些问题的评委把你黑掉。但你不能把所有同行都回避掉，哈哈。

5、仔细审查自己的申请人资格是否达到NSFC要求

报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：

1、项目的立项依据

随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产

儿存活率已显著提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。

目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最

常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入

研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。

高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤（弥散

性肺泡炎）和晚期的损伤后修复（肺间质重构）两个过程。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重建正常，则损伤完

全修复，肺结构正常；若ECM重建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中基

质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs 失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因 [1]（具体研究成果见研究基础栏）。有关MMPs在高氧肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMPs过度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs的诱导剂和抑制

剂两方面深入研究。

细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin）在上调MMPs表达中起关键作用。Emmprin是分子量为58KD的质膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部

肿瘤细胞，提示Emmprin参与体内生理及病理过程[2]。目前，少数文献已证明，体

外Emmprin与人成纤维细胞共培养后，成纤维细胞MMPs表达增加。进一步研究表明，Emmprin在细胞表面与自身受体或MMP结合，激活胞内MAPK p38信号通路，该途径

激活促进ECM降解[3，4]。但关于Emmprin/MAPK p38对MMPs调节的研究仅限于肿瘤

细胞，有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，Emmprin如何MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。

转化生长因子β（Transforming growth factor beta, TGF-β）在下调MMPs表达中起关键作用。研究证明TGF-β刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少[5]。另有研究发现，TGF-β抑制元件位于MMP-1基因启动子区，严密MMP-1在不同生理和病理

情况下的表达[6]。进一步的研究表明，TGF-β对MMP-1的作用通过SMAD信号途径介导，该途径激活可阻止ECM降解[5]。因此，推测TGF-β/SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM重建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，TGF-β如何MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。

近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm大小的囊性凹陷结构—小窝（caveolae），是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白（caveolin）是小窝胞浆面包被的一种21-24kD的膜蛋白，是许多信号分子活性

状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin通常与富集于小窝质膜上的各种

信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动

剂与受体结合后，caveolin分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，

参与信号转导[7]。有关caveolin在肺ECM重建中的作用，有学者提出肺泡Ι型上皮细胞caveolin表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1α在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布[8]。研究发现，caveolin –1与TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）相互作用，抑制TGF-β介导的SMAD-2和下游分子的

磷酸化，从而调节信号转导[9]。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为

酪氨酸磷酸化依赖的MAPK p38途径，申请者推测caveolin能与Emmprin相互作用，

Emmprin介导的MAPK p38和下游分子的磷酸化。简图如下：

胞外信 caveolin +? caveolin/Emmprin作用 Emmprin/MAPK p38

号刺激变构活化+ caveolin/TβRⅠ作用 TGF-β/SMAD

信号整合肺ECM重建

基于上述，申请者提出如下假设：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损

伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而

影响Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。

本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高

氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺

泡灌洗术、体外Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗

氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所

起的作用进行了较深入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、

EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累

为本课题的开展奠定了坚实的基础。本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM 重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。

参考文献

1.Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN

stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-72

2.Liang L, Major T, Bocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix

metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-86

3.Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix

metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38.

FEBS Lett 1998;441(1):88~92

4.Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix

metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-10

5.White LA, Mitchell TI, Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory

element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-68 6.Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-beta/SMAD signaling

through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2001;276

(9):6727~6738

7.Ramirez MI, Pollack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of

Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33~42

8.Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary

defects in caveolin-1 gene-disrupted mice. Science 2001;293(5539):2449~52

2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究目标：

建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，探讨Emmprin与TGF-β调节失衡是否为高氧肺

p38和TGF-β/SMAD 损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对Emmprin/MAPK

两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。

研究内容：

1.Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性：

①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38的表达。

②研究高氧肺损伤Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态与MMPs表达双变量关系。

2.TGF-β/SMAD信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性：

①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中TGF-β、TβRΙ、SMAD、磷酸化SMAD的表

达。

②研究高氧肺损伤TβRΙ的激酶活性，计算磷酸化SMAD与非磷酸化SMAD比值。

③研究高氧肺损伤TGF-β/SMAD信号通路的活化状态与MMPs/TIMPs的双变量关系。

3.caveolin-1对Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路及其与高氧肺损伤所

致ECM重建紊乱的相关性：

①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中caveolin-1表达及酪氨酸磷酸化水平。

②研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与Emmprin的共定位。

③研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与TβRΙ的共定位。

拟解决的关键问题：

1.成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤

情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高

氧肺损伤模型，能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度

较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型

的复制。

2.本研究假设caveolin与Emmprin的相互作用可Emmprin/MAPK p38信号通路活

化；caveolin-1与TβRΙ的相互作用可TGF-β/SMAD信号通路活化。以往由于

技术条件，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记

技术可解决这一技术难题。

3、拟采取的研究方案及可行性分析。

研究方法：

本课题采用共聚焦显微镜（confocal microscope）、免疫荧光双重标记和免疫组织

化学等研究方法，辅以蛋白质与核酸分析技术（Western Blot、Northern Blot方法），检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。

1.建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型：

参照申请者著作，实用儿科临床杂志，

⑴.检测caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：

①应用抗caveolin-1pAb 进行免疫沉淀

②应用抗磷酸化酪氨酸mAb 进行Western Blot分析

⑵.检测肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38 、TGF-β、TGF-βΙ型受体（TβRΙ）

及SMAD-2、磷酸化SMAD表达，探讨高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的分子机制：

①蛋白质水平检测—Western Blot。

②mRNA水平检测—Northern Blot（或RT-PCR）。

⑶.检测肺组织中TβRΙ的激酶活性：

① TβRΙ分离提取—免疫沉淀法（immunoprecipition）

② TβRΙ与纯化的激酶底物GST-SMAD2（由美国国立癌症研究机构de Caestecher,

M教授提供）反应，应用免疫印迹法检测磷酸化SMAD2水平，计算TβRΙ的激酶活性。

⑷. 检测肺组织质膜小窝内caveolin /Emmprin及caveolin-1/TβRΙ的共定位及表

达：

①样本制备：制备组织切片→加入抗caveolin mAb→PE标记的二抗→加入抗

Emmprin/TβRΙ的pAb→FITC标记二抗

②共聚焦显微镜（TCSSP型，德国Leica公司）检测共定位；应用图象分析软件

对caveolin表达强度进行半定量。

⑸．应用统计学方法处理数据：

应用SAS统计分析软件，对数据进行统计学分析。

技术路线：

早产大鼠高氧肺损伤模型

caveolae caveolin酪氨酸磷酸化状态

（免疫沉淀、免疫印迹）

Emmprin/MAPK p38 TGF-β/SMAD

信号通路研究信号通路研究

Emmprin、P38、磷酸化P38 TGF-β、TβR、SMAD、磷酸化SMAD

表达（免疫印迹与Northern Blot 表达（Western Blot和Northern Blot）或RT-PCR) TβRⅠ激酶活性（免疫沉淀和免疫印迹）

可行性分析：

1.

申请者所在的研究室属于呼吸系统疾病重点实验室临床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化发病机制的研究领域已有大量工作积累，为本项目的研究打下了良好的工作基础。申请者及所在研究室在产儿高氧损伤领域进行了一系列开拓性研究，已熟练掌握急、慢性高氧肺损伤模型复制，蛋白、核酸分析等技术。

（详见研究基础栏）

2.本项目研究的主要成员之一，合作者教授，是国际上新生儿肺损伤研究的前沿科学家，目前与本研究小组密切合作，进行有关慢性肺损伤研究。霍泰辉教授除承担实验指导，并提供部分试剂。

3.新一代共聚焦显微镜具有观察亚细胞结构的立体定位功能，用其检测在体组织caveolin/Emmprin 、caveolin/ T

βR Ⅰ信号分子在亚细胞位点的共定位表达，虽无文

献报道，在技术上难度较大，但申请者已掌握了多种荧光标记技术，应用共聚焦显微

镜观察caveolin-1

在细胞质膜上的定位表达也已获成功。

申请人所在单位的医学中心

的共聚焦显微镜和本实验室的基本研究设备，能保证本实验研究完成。

4、本项目的特色与创新之处。

理论上的创新：

研究Emmprin/MAPK p38信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用,国内外

尚无文献报道。

本课题研究caveolin 对Emmprin/MAPK p 38、TGF-β/SMAD 共调节机制，将为早产儿高氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域，并为其防治开拓新思路。方法上的创新：

以在体组织为研究对象，应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究caveolin/Emmprin

、caveolin/T

βR Ι共定位，国内外未见文献报道，可望为深入研究

小窝蛋白对信号转导的机制开辟新途径。

5、年度研究计划及预期研究结果。

年度研究计划及预测进展

本课题研究内容预计用3年时间完成.

2004年1月~8月

①购买所需试剂。②建立预实验动物模型。③进行各项预实验。 2004年9月~2005年2月

①建立动物模型。②完成标本的收集。 2005

年3月~7月

完成MMPs 、TIMPs 、TGF-β、T βR Ι、SMAD2及其mRNA 表达的研究，并进行阶段性总结。

2005年8月~2005年12月

完成caveolin-1表达和caveolin-1/T βR Ι共定位研究，并进行阶段性总结。

2006

年1月~2006年6月

caveolin/Emprin 共定位

(荧光双标记、共聚焦显微镜

)

caveolin/ T βR Ⅰ共定位

(荧光双标记、共聚焦显微镜

)

2006年7月~12月

研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。

预期研究成果

本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型，不仅为本课题提供了研究对象，而且为研究高氧肺损伤后肺ECM重建提供了模型。

本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝

表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依

据。

（二）研究基础与工作条件

1、工作基础

1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩

本课题组多年来一直进行高氧肺损伤的发病机制及防治的研究，做了许多基础和临

床研究工作。已成功建立早产新生大鼠高浓度氧（85%～95%）急性肺损伤和慢性肺纤维

化的模型；已完成肺组织中各种抗氧化酶活力、羟脯氨酸含量与肺纤维化的相关性研究；

内源性一氧化氮在高氧肺损伤中双重作用的研究；体外高氧对肺泡巨噬细胞分泌IL-8的影响研究；TGF-β在早产大鼠高氧肺损伤肺组织中表达的研究；基质金属蛋白酶及其

抑制剂在高氧肺损伤中的作用机制的研究；及促红细胞生成素、地塞米松、维甲酸对新

生鼠高氧肺损伤的干预研究。

获奖课题

目前正承担的相关科研项目：

1.

2.

相关研究工作发表的文章：

附：基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用

1. 高氧组病理学改变

2. 高氧组MMPs表达

图1 肺发育不良，示肺泡图2 细胞增生、间质纤维图3 MMP-2强阳性表达数目减少、结构简单化改变

3. 酶谱法测BALF中明胶酶活性

4. 高氧暴露后MMPs、TIMPs表达增加

MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2

3d O2 0.46±0.36 0.90±0. 2.00±0.47 0.30±0.23

air 0.07±0.10 0.07±0.16 0.87±0.58 0.03±0.08

7d O2 1.33±0.60 0.11±0.45 2.60±0.71 1.15±0.34

air 0.36±0.43 0.17±0.35 1.70±0.35 0.06±0.1014d O2 3.40±0.53 2.75±0.66 3.37±0.45 2.43±0.18

air 1.30±0.90 0.33±0.31 2.82±0. 0.08±0.10

21d O2 3.73±0.46 3.35±0.60 3.88±0.11 1.90±0.38

air 0.30±0.14 0.60±0.10 2.54±0.55 0.30±0.14图4 高氧组条带亮度增强，示活性增强高氧组与对照组比较均P＜0.05

2、工作条件

1)研究所需实验动物，均有实验合格证。

2)申请者所在医院的分子医学中心设备可协助完成Western blot 、northern

blot、免疫沉淀等实验。

3)Caveolin-1抗体由Division of Hematology/Oncology/BMT Department of

Pediatrics Emory University School of Medicine教授有偿提供。本项目所

需的其它抗体、分子探针和试剂国外均有售，或由合作者Fok TF赠送。

总之，申请人所在的医院及大学的实验条件，完全能够满足该项目的研究要求。

3、申请人简历

4、承担科研项目情况

1．由本项目申请者负责。主要探讨EGB761对高氧肺损伤早产新生大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子如TNF-α、IL-8，IL-1、IL-6、MMPs、TIMPs及其mRNA的影响。

2．早产儿贫血临床治疗的研究由本项目申请者负责。

3．支气管肺泡灌洗技术在新生儿肺部疾病中的应用研究“新技术、新业务”资助项目。