AKTA 简要操作说明

  打开仪器的主电源，打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。 

  Unicorn Manager文件管理、Method Edit方法编辑、System Control系统控制、Evalution结果处理，4个窗口同时打开，同时关闭。 

  Unicorn Manager中Manual运行的结果自动保存在Manualruns的文件夹中，文件名从Manualrun1~Manualrun10，第11个结果会覆盖第1个文件（最多保存10个默认的文件名）。如果手动结果需要长期保存，可以remove到指定文件夹或者rename。可以利用Manual-other-record-on（off）来选择文件夹，制定文件名保存手动结果。 

  手动命令(Manual)见《ÄKTA系统手动命令指南》 

  利用脱盐实验熟悉手动操作(System Control→Manual) 

脱盐试验原理：凝胶过滤 (或称分子筛) 层析是一种由分子通过多孔基质，按分子大小分离混合分子的技术 。蛋白质是生物大分子，分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、可靠 。由于层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程。Sephadex G-25 介质用带3- 氯-1 ，2- 环氧丙烷(epichlorohydrin) 交联葡聚糖加工成珠状的介质。适合分子量在5000 以下的生物分子的脱盐及缓冲液置换工作。在该实验中，蛋白质是大分子，盐离子是小分子，因此蛋白质先出来（280nm有特征吸收），盐离子后出来（电导值显示） 

o 样品：5mg/mLBSA， NaCl溶液 10mL 

o binding buffer缓冲液：去离子水 

o 层析柱：HiTrap Desalting 5 mL 

o 流速：5mL/min, 

o 样品体积：200ul/1mL。 

操作： 

1）准备工作溶液和样品 

所有的工作溶液和样品必须经过µm的滤膜过滤，使用前用低频超声脱气10min。 

2）清洗及管道准备 

首先将A1管道放入binding buffer中，在System Control窗口点击工具栏内的Manual，选择 Pump→Pump wash purifier，选中A1管道为ON， Execute。泵清洗将自动结束。 

3）安装层析柱： 

在Manual里选择Pump→Flow rate，输入流速5mL/mL，Execute，读取系统空压X Mpa（没有安装层析柱的系统压力），选择Alarm&mon→alarm pressure，设置high alarm,输入X+（填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），Execute。Flow rate，输入流速1mL/mL，Execute，待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。改变Flow rate，输入流速5mL/mL，Execute 

4)开始纯化： 

o 选择检测波长，Alarm&mon→Wavelength→UV1,UV2,UV3(可以只打开一个波长280nm)等待柱子平衡好了（观察电导COND，pH的数值和变化趋势）就准备上样了。此时将紫外调零，选择Alarm&mon→autozero，Execute。 

o 用样品环上(也可在平衡时将样品推入样品环)：将样品吸进注射器，推掉气泡，从InjectionValve的3号位推入，推好后不要取下注射器。在Manual里选择Flowpath→InjectionValve→Inject，Execute。 

o 设定收集： 

固定体积收集：（如果有出口阀）Manual→Flowpath→outletvalve→F2，insert，选择Frac→Man_fractionation，输入每管收集体积，insert，exectue。结束固定体积收集选择Frac→fractionation_stop，exectue。 

峰收集：选择Frac→Peak_fracParametersUV_Level,设定峰收集的参数，insert，选择Frac→Peak_Man_fractionation设定峰收集每管收集的体积，insert，Execute。结束峰收集选择Frac→Peak_frac_stop，Execute。 

5）清洗泵及卸下层析柱： 

将A1入口放入纯水中，启动Pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。设定Flowrate，alarm pressure，清洗柱子和管路，直至cond~cm，UV几乎不变；然后再将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程防止气泡进入。 

6）关闭电源： 

从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭ÄKTA主机电源，关闭电脑电源。 

  结果处理Evaluation 

1）图形或数据拷贝、导出 

在Unicorn软件Evaluation界面Open结果文件 

图形拷贝：空白处→右键→copy to clipboard →open word→paste得到结果的图形 

在Evaluation界面，File→Export→Curves 

选中206nm →Select→ Export 

→Excel files→OK 

2）积分工具和柱效测定 

在Unicorn软件Evaluation界面打开结果文件夹。 

积分：Integrate → Peak integrate 

→选择待积分曲线，如：UV1_280nm 

→Peak window(调整积分区域，使其包含主峰) 

→Reject Peaks (Peaks must be one of 1or 几个 largest) 

→Baseline(选择Correlated baseline) 

→Column height：输入实际柱高，如 90cm 

→OK 

Chromatogram Layout→Peak Table 

→Plate height(HETP) 

→Asymmrtey 

→OK 

可得到柱效（HETP），对称性（As） 

Tip：如果峰之间没有达到基线分离，则Baseline→选择Calculate baseline计算的基线→Baseline settings→ Morphological形态学→Structure width（mL，在多少mL中选取比较平滑的线作为基线，该数值设置大一些） 

  新建柱子 

具体软件操作如下： 

①在Unicorn软件Method Editor界面中选择Edit→ Column List 

②新建一根自己的柱子：New 

③→New Column中输入柱参数：输入Height，柱子直径diameter；输入其他相关参数：Vt，Vo，Max Pressure，Default Flowrate，Max Flowrate等，然后Save As特定的柱名。 

这样在Column List中 就有了我们自己编辑好的层析柱。 

  新建方法： 

在Unicorn软件Method Editor界面中选择File→New→Wizard→OK 

Main Selection层析方式选择：Affinity、Anion/Cation Exchange、HIC、Size exclusion 

→Column：Any（或者预装柱）→Flexible Flow Rate在不同阶段用不同流速→Next 

Wavelength 波长选择UV：280nm →Pump Inlet入口选择→Next 

Equalibration： Start Concentration %B起始浓度选择→Equalibration Volunme： CV平衡体积→Watch Equlibration和前一个条件是满足任一条件，就跳入下一步。 

Sample Injection：Injection Technique: Manual注射器上样 → Empty Loop With：1mL； 

或者 System Pump Direct Loading系统泵直接上样→Injection Volume 上样体积（必须>10mL），默认样品入口为A2(如果HIC，默认B2) →Next 

Wash Out Unbound Sample清洗未结合蛋白，默认2CV（最后参数表可以修改）→Flowthrough Fractionation穿透峰收集（Frac-900、OFF、Outlet F3出口阀F3收集）→Next 

Elution Fractionation洗脱收集→Frac-900收集器收集、OFF、Outlet出口阀收集→Fixed Volume Fractionation固定体积收集、Peak Fractionation峰收集、Fixed Volume and Peak Fractionation固定体积和峰收集相结合→Fraction Volume固定体积收集每管体积→Next 

Peak Fractionation设定峰收集→Peak Identification →UV Level峰高度、UV Slope紫外斜率→Minimum Peak Width最小峰宽（排除气泡峰）→Peak Fractionation Volume→Next 

Elution洗脱模式(根据工艺选择一种设定) 

①Isocratic等度洗脱（凝胶过滤）→Length of Elution 洗脱体积→Finish 

②Isocratic with Delayed Frationation延迟峰收集的等度洗脱→Length of Elution before Fractionation 从开始采进行峰收集→Length of Elution with Fractionation →Finish 

③Linear Gradient 线性洗脱→Target Concentration目标变化浓度→Gradient Length梯度长度（一般10~20CV）→Use cond or concB to start and stop Fractionation利用电导或B%开始或者停止收集→Clean after Elution at 100B%(5CV)清洗→Reequilibration after Elution(5CV)再平衡→Finish 

④Segmented Gradient Advanced高级梯度→ Gradient Segments最多可以设定9个步骤 

Elution –Segment1(1)-Page1(2) →Step阶段梯度\\Gradient线性→Pump Inlet A入口→Concentration B浓度→Length of Step 梯度长度 

Fraction Volume 固定体积收集→Peak FractionVolume 峰收集设定→设定剩下的梯度后→Finish 

Variables →Show details检查各个参数，可以修改→Save 

  运行方法 

System Control→Run→方法→OK→Variables检查一下参数→Evalution Procedures→Method Information/Method Duration总体体积和运行时间→Next→Questions→Directory结果保存文件夹/Name结果名→Start