_70_超低温冻存细胞的实验研究

【实验研究与检验技术】

270℃超低温冻存细胞的实验研究

汪小瑛,张拥军,徐红麟,王美爱

摘要:[目的]探索270℃超低温条件冻存细胞的可行方法。[方法]用270℃超低温冰箱冻存对数生长期的C6/36、

B H K 221、Vero 和MD

C K 细胞,冻存30、60和90d 后,37℃水浴复苏,用M T T 法测定细胞活性,计算冷冻存活率;同时观察复苏细胞形态,并与液氮冻存方法同步比较。[结果]270℃冻存后复苏细胞均可获得90%以上的存活率,与液氮冻存细胞的复苏效果类似。光镜下显示,冻存细胞均可在拟定的冻存期内成功复苏。复苏即时镜下90%以上的细胞呈现良好的活细胞形态悬浮在培养基中。[结论]270℃超低温冰箱冻存细胞的方法可行,尤其适用于基层或液氮来源困难地区开展细胞培养研究。　　关键词:细胞冻存;270℃超低温;医学实验;存活率　　在体外细胞培养和各种细胞的实验研究及临床应用中,为防止细胞系(或细胞株)的退变和污染,选择液氮深低温(2196℃

)作为制冷源是迄今长期保存细胞的最佳方法。但由于使用液氮条件不同,基层开展细胞培养研究受到一定。为此,我们尝试利用270℃超低温冰箱探索改进细胞的冻存方法。

1　材料与方法

111　材料与仪器设备　普通冰箱(4℃),270℃超低温冰箱,Multiskan M K 3全自动酶标仪,2ml 冻存管和25cm 2细胞培

养瓶(CORN IN G ),120×86mm 程序降温盒(Nalgene ):使用前

在盒的夹层内装入100%异丙醇溶液250ml (溶液可重复使用5次),可放置110～210ml 冻存管18支。DM EM 和RP 2MI10细胞培养液(分别为HyClone 和GIBCO/BRL ),胎牛

血清(FBS ,杭州四季青公司),异丙醇(国药集团化学试剂有限

公司),DMSO 和M T T 试剂(Amresco )。冻存保护液:含10%DMSO 、90%FBS ,现配现用。待冻存细胞:C6/36、B H K 221(P 32)、Vero (P 24)、MDC K (P 19)细胞均为本实验室传代保存。

112　细胞冻存　按常规方法分离、收集处于对数生长期的

C6/36、B H K 221、Vero 、MDC K 细胞,计数细胞总数:加入冻存

保护液制备成密度为1×106个/ml 单细胞悬液;混匀分装于冻

存管,110ml/支。将冻存管逐一放入装有异丙醇溶液的程序降温盒中,置270℃冰箱分别冻存30d 、60d 和90d 。同步进行各类细胞的液氮冻存。113　细胞复苏　从冰箱中依次取出细胞冻存管,立即置37℃水浴中摇动,1min 内使其完全融化,将融化的细胞悬液以无菌操作转入细胞培养瓶中定容至原体积,同步观察复苏细胞形态;

37℃(C6/36细胞于33℃

)5%CO 2培养箱静置培养2～3h ,观察细胞贴壁情况;贴壁完成后,全量置换新鲜培养液继续培养,次日观察细胞生长情况。同步复苏液氮冻存的各类细胞。114　细胞活性检测　分别对270℃和液氮冻存细胞的复苏效果进行3次实验。对照组为未冻存细胞,空白孔为不含细胞的完全培养基。按M T T 法测定细胞活性( x ±s )[1],计算冷冻

存活率。M T T 法具体操作过程参照文献[2]。2　结果

211　细胞存活率　M T T 法测定均值表明,270℃冻存细胞复苏后均可获得90%以上的冷冻存活率,与液氮冻存细胞的复苏效果类似(P >0105),见表1。表1　MTT 法测定冻存细胞的存活率(n =6, x ±s )

时间(d )

C6/36

OD490值存活率(%)

B H K 221

OD490值存活率(%)

Vero

OD490值存活率(%)

MDCK

OD490值存活率(%)

30d101360±010019314±11001368±010019514±11101370±010029511±01801366±010039411±11160d101359±010019311±11001367±010029512±01901368±010029416±01401363±010039313±11090d101358±010019219±101001365±010029416±01901367±010029414±01501362±010029311±01830d2013±010049413±11001370±010019519±01901371±010029514±01801371±010029513±01660d201363±010049410±11101369±010029517±11001370±010049513±01801370±010029510±01790d2

01363±010049410±11101369±010029517±11001367±010029512±01901370±010039510±017对照

01386±01005

10010±0

01386±01005

10010±0

013±01002

10010±0

013±01002

10010±0

　　注:以对照组为100%计算;1为冰箱组,2为液氮组。

第一作者简介:汪小瑛(1959—

),主管技师,从事病毒性疾病的预防控制工作。

作者单位:福建省疾病预防控制中心,福州350001。

212　细胞生物学特性　光镜观察显示,C6/36、B H K 221、Ve 2ro 、MDC K 冻存细胞均可在拟定的冻存期内成功复苏。复苏

即时镜下可见90%以上的细胞呈现透明、类圆形饱满良好的

活细胞形态悬浮在培养基中;置5%CO 2培养箱静置培养2～

3h 完成细胞贴壁过程;次日观察复苏细胞在培养状态下增殖活跃,细胞数目开始成倍增多;复苏细胞进一步培养可获得致密的单层细胞,且具有各类细胞自身典型的形态特征,半贴壁细胞仍为圆形、球状,贴壁细胞仍为梭形。

3　讨论

冷冻速率直接关系到冷冻效果。冷冻速度不同,细胞内水

分向细胞外流动的情况会不同[3]。在慢速冷冻中,随着冷冻温度的降低,冰晶先在细胞外液发生,尔后不断增大,游离水减少,细胞外液渗透压增高,致使细胞内水分外逸,细胞内渗透压升高造成细胞“溶质性损伤”。快速冷冻降温速度很快,细胞内水分未及外逸即被冰结,此时细胞内外形成许多小结晶,除压迫性损伤外,在其复温过程若复温速率较慢,则会形成再结晶对细胞的损伤。因此,在降温和复温过程中,必须选择最佳速率,使上述因素对细胞的影响减到最低。

本研究结果表明,C6/36、B H K 221、Vero 、MDCK 细胞在冻存30d 、60d 和90d 复苏后均可获得90%以上的冷冻存活率。成功的原因:①应用程序降温盒“缓慢冰冻”。将Nalgene 公司生产的程序降温盒与270℃超低温冰箱结合运用,可实现每分钟1℃的降温;程序降温能克服降温速度过快或过慢对细胞造成的“溶质性损伤”和“胞内冰损伤”,大大提高了冻存细胞的存活率。②冻存保护液的优化。一般情况下,用于冷冻保存的完全细胞生长培养液中血清浓度为20%。本实验使用高浓度血清(90%FBS )的冻存保护液,不但降低了冻存和复苏对细胞造成的损伤,还确保了冻存保护液中高密度细胞的营养供给,保证了细胞的生长质量,缩短了细胞复苏后的增殖周期,亦大大提高了冻存细胞的存活率。③冻存保护液的预处理。DM 2

SO 在常温下对细胞的毒副作用较大[3],能破坏细胞膜和细胞

内的多种酶,4℃时,其毒副作用大为减弱;本实验对冻存保护

液采用先行配制,重悬后即转入4℃冰箱保存,这样可减少DMSO 稀释时放出的大量热能对细胞造成的损伤。实验结果表明,应用-70℃超低温冰箱冻存细胞,短期内对细胞无明显影响,与液氮冻存细胞的复苏效果类似。本方法只对冻存时间在90d 内的细胞进行复苏实验,若时间超过90d ,其复苏效果与液氮是否相同值得进一步探讨。本方法与传统常规的细胞冻存方法比较而言,简便易行,冻存效果好,可提高工作效率,尤其适用于基层开展细胞培养的研究。

参考文献:

[1]朱文箐,金慰芳,张丽丽,等.M T T 法分析培养成骨细胞的存活和

增殖能力[J ].上海医科大学学报,1995,22(4):2542256.

[2]汪小瑛,王美爱,吴冰珊,等.不同冷冻速率冻存C6/36细胞复苏效

果比较[J ].海峡预防医学杂志,2006,1(5):37238.

[3]薛庆善.体外培养的原理与技术[M ].北京:科学出版社,2001:1292

136.

收稿日期:2008208204;收稿日期:2008208220

第一作者简介:于凌志(1960—

),女,主管技师,从事理化检验工作。作者单位:福建省疾病预防控制中心,福州350001。

文章编号:100722705(2008)0620051202　中图分类号:R 155.5　文献标识码:A

【实验研究与检验技术】

气相色谱快速测定面粉中过氧化苯甲酰

于凌志,林国斌

摘要:[目的]建立用气相色谱快速测定面粉中过氧化苯甲酰的方法。[方法]面粉中过氧化苯甲酰在酸性条件下

被还原为苯甲酸,经溶剂提取、浓缩,用DB 2WAX 型毛细管柱分离,用气相色谱带FID 检测器检测。[结果]用苯甲酸作标准曲线,在0～50μg/ml 范围内线性良好,回收率9312%～9514%,相对标准偏差113%～412%。[结论]本方法简便,试剂用量少,准确度、精密度高。　　关键词:面粉卫生;过氧化苯甲酰;气相色谱法;卫生检验　　由于过氧化苯甲酰(BPO )具有使面粉增白、增筋、杀菌及提高面食制品储藏性等效果,已被许多国家作为面粉改良剂。我国20世纪90年代初就将过氧化苯甲酰作为面粉中普遍使用的食品添加剂。但过量加入过氧化苯甲酰会造成食物中β2胡萝卜素、维生素等的大量破坏,且其还原物苯甲酸的摄入量过多也对人体有害,因此,各国都规定了限量标准。我国的面粉中过氧化苯甲酰的限量标准为0106g/kg 。目前,我国过氧化苯甲酰的检测方法有碘量法、气相色谱法和液相色谱法,但其样品前处理均较繁琐,试剂消耗较多[224]。本文通过对样品前处理的改进,以DB 2WAX 0125mm ×0125μm ×30m 毛细管柱作为分离柱进行气相色谱检测,方法简便、快捷;使用试剂少;结果准确可靠。

1　材料与方法

111　试剂与仪器　石油醚(30℃～60℃)、冰乙酸、丙酮,均

为分析纯。苯甲酸(99%)、过氧化苯甲酰(99%)购自美国Sig 2

ma 公司。酸性石油醚:在500ml 石油醚中加入15ml 冰乙酸,

混匀备用。过氧化苯甲酰、苯甲酸标准储备液的配制:准确称

取过氧化苯甲酰和苯甲酸各011000g ,分别用丙酮溶解并转移至100ml 容量瓶中,溶液浓度均为1000μg/ml ,储存于4℃冰箱。气相色谱仪(岛津GC 217A )、带火焰离子化检测器(FID )、离心机、50ml 带盖离心管、漩涡混合器和吹氮仪。112　方法11211　原理　面粉中的过氧化苯甲酰在酸性条件下被还原,生成苯甲酸,经溶剂提取、浓缩,用气相色谱法测定。11212　试样处理　称取试样2150g 放入50ml 带盖离心管中,加入1510ml 酸性石油醚,把盖旋紧,放在漩涡混合器上混合5min ,每隔30min 混匀1次,4h 后放置3000r/min 离心5min ,分层后用移液管移取上清液5100ml ,加入带塞的5100ml 比色管中,用氮气吹干比色管中的溶剂后,移取1100ml 丙酮至比色管中,溶解残渣以备进样用。11213　气相色谱条件　DB 2WAX 0125mm ×0125μm ×30m 毛细管柱;进样口温度280℃;柱温230℃;检测器温度300℃;柱压1510kPa ;柱流量20ml/min ;进样量均为110μl 。11214　标准曲线的制作　上述苯甲酸标准储备液用丙酮逐级