斑马鱼整体原位杂交详细步骤

一. 原位杂交第一天

　　1. 重新水化和固定 

　　1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。 

　　2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟 

　　3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次 

　　4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟 

　　5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。 

　　蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步） 

　　1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。 

　　2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。 

　　3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。 

　　4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。 

　　2. 预杂交 

　　1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。 

　　2）用等体积的HYB+取代HYB－。 

　　3）60℃水浴，预杂交4小时以上。 

　　3. 杂交 

　　1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）.. 

　　2）60℃ 温浴过夜。 

　　注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 

二. 原位杂交第二天

　　1. 

　　1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。 

　　2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。 

　　3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。 

　　4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。 

　　2. 

　　1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。 

　　2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。 

　　3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。 

三. 原位杂交第三天

　　1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。 

　　2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。 

　　3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。 

　　4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色 

　　5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。 

6）4C冰箱保存。 

原位杂交中溶液的配制： 　

PBS: 

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

DEPC H2O 1L

HCl 调PH值至7.4

抽滤，灭菌

4% 多聚甲醛：

多聚甲醛 40g

PBS 1L

加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存

PBST：

PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

20XSSC: 

Na3Citrate 2H2O 88.2g

NaCl 175.5g

DEPC H2O 至1L

抽滤，灭菌

SSCT： 

SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

HYB-： 

甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2：1：1配制

加入Tween-20使其终浓度为0.1%，-20c保存。

HYB+： 

HYB- 20ml

yeast RNA 10mg

heparin 1mg。

-20℃保存。

MAB： 

maleic acid 11.6g

NaCl 8.8g

用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.5

4℃保存

MABT：

MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.

10% blocking reagent: 

blocking reagent 8g

MAB 72ml

MABT+blocking reagent溶液：

灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7

用时现配

Staining buffer：

Tris 12.1g

pH9.5

Mgcl 6H2O 10.2g,

Nacl 5.85g

Tween-20 1ml,

用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM。