萌发麦种淀粉酶活力的测定

实验⼆萌发麦种淀粉酶活⼒的测定

⼀、实验背景及⽬的

⽲⾕类作物作为最重要的粮⾷作物，对其种⼦技术的研究对于提⾼我国种业发展⽔平、保障国家粮⾷安全有重要意义。【1】休眠的种⼦中只有β-淀粉酶，萌发时胚释放出来的⾚霉素能诱导糊粉层细胞中α-淀粉酶基因的表达，引起α-淀粉酶⽣物合成，分泌到胚乳中。【2】两种酶共同催化淀粉⽔解为糖，为细胞以及细胞⽣长提供原料。【3】【4】本实验通过测定萌发麦种淀粉酶活⼒，更好的了解酶在⽣物代谢中的作⽤。

⼆、实验原理

淀粉是植物最重要的贮藏多糖，也是⼈和动物的重要⾷物和发酵⼯业的基本原料。淀粉经淀粉酶作⽤后⽣成葡萄糖、麦芽糖等⼩分⼦⽽被机体利⽤。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，在⽲本科植物萌发过程中，这两种酶的活性最⾼。【5】α-淀粉酶可随机地作⽤于淀粉中的α-1,4-糖苷键，⽣成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此⼜称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的⾮还原性末端进⾏⽔解，每次⽔解下⼀分⼦麦芽糖，⼜被称为糖化酶。【6】【7】

研究发现他们各有其⼀定的特性：α-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下则发⽣钝化；β-淀粉酶不耐热，在⾼温下易钝化。利⽤不同特性，钝化其⼀，即可测定另⼀种酶的活性。测定α -淀粉酶活性时，可将提取液加热到70°C 维持 15 分钟来钝化β-淀粉酶；【8】【9】⽽测定β-淀粉酶时，可⽤ pH3.6 的醋酸缓冲液处理提取液，以钝化α-淀粉酶。实验应该严格把控钝化条件。

淀粉酶活⼒的⼤⼩与产⽣的麦芽糖量成正⽐，可⽤ 3,5-⼆硝基⽔杨酸法进⾏测定。还原糖和碱性⼆硝基⽔杨酸试剂共热，产⽣⼀种棕红⾊的氨基化合物。⽤实验体系中单位时间内⽣成的麦芽糖毫克数表⽰淀粉酶活⼒的⼤⼩。在实验中要严格控制温度及时间，保证酶的最适条件及初速度状态，以减⼩实验误差。【10】【11】

本次实验分为两部分，⼀是通过纯化β-淀粉酶活⼒完成α-淀粉酶的活⼒测定，⼆是不进⾏任何钝化处理测定总酶活⼒。

三、实验材料、仪器和试剂

1.仪器：电⼦天平(HC-TP11-1架盘药物天平，上海精科)、低温冷冻离⼼机(Eppendorf 5804R离⼼机)、恒温⽔浴锅(DK-S24型电热恒温⽔浴箱，上海精宏实验设备有限公司)、可见分光光度计(722N可见分光光度计)。

主要器具：移液器、研钵、容量瓶、15 毫升具塞刻度试管、烧杯等。

2.试剂

(1)1%淀粉溶液：称取 1g 可溶性淀粉，加⼊ 80ml 左右蒸馏⽔，在电炉上加热溶解，等冷却后，定容到 100mL。

(2) pH5.6 的柠檬缓冲液： A 液：称取柠檬酸 20.01g，溶解后定容到 1L。 B 液：称取柠檬酸钠 29.41g，溶解后定容到 1L。取 A 液 5.5mL、B 液 14.5mL 混匀，即为 pH5.5 柠檬酸缓冲液。

(3) 3, 5-⼆硝基⽔杨酸溶液：称取 3, 5-硝基⽔杨酸 1.00g，溶于 20mL 1M NaOH 中，加⼊ 50mL 蒸馏⽔，再加⼊ 30g 酒⽯酸钾钠，待溶解后，⽤蒸馏⽔稀释⾄100mL盖紧瓶塞，勿使⼆氧化碳进⼊。

(4)麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100g, 溶于少量蒸馏⽔中，仔细移⼊100mL容量瓶中，⽤蒸馏⽔定容到100mL。

(5)0.4M NaOH。

3.实验材料：萌发的⼩麦种⼦(芽长 1 厘⽶左右)。

四、操作步骤

1.酶液的制备

称取2g萌发的⼩麦种⼦（芽长 1cm）置于研体中，加少量⽯英砂和 2mL 蒸馏⽔研磨，得到匀浆。转移到 50mL 容量瓶中⾄40mL 左右，室温浸提 15-20 分钟，充分浸提后定容到刻度，混匀。于4℃，3500 转/分离⼼ 20 分钟，取上清液备⽤(初始酶液)。

2.α-淀粉酶活性的测定

(1)取试管 4 ⽀，注明两⽀为对照管，两⽀为测定管。

(2)于每管中各加酶提取液 1mL，在70°C 恒温⽔浴中加热15min，取出后⽴即在冰浴中冷却⾄少三分钟。

(3)在试管中各加⼊ 1mL pH5.6 柠檬酸缓冲液。

(4)将测定管和对照管置于40℃(±0.5℃)恒温⽔浴中准确保温 15 分钟后，向两⽀对照管中各加⼊ 4ml 0.4M NaOH, 再向各管分别加⼊40℃下预热的淀粉溶液2mL，摇匀，⽴即于40℃⽔浴中准确保温 5 分钟，然后向两⽀测定管分别迅速加⼊ 4mL

0.4MNaOH，摇匀。然后准备下步糖的测定。

3.α-及β-淀粉酶总活性的测定

取所制备的酶液5mL放⼊100mL容量瓶中，⽤蒸馏⽔稀释⾄刻度，混合均匀后，取 4 ⽀试管，2⽀为对照管，2⽀为测定管，各加⼊稀释后的酶液 1mL及pH5.6柠檬酸缓冲液1mL,以下步骤重复α-淀粉酶测定的第(4)步的操作。

4麦芽糖的测定

(1)标准曲线的制作

取15ml具塞刻度试管7⽀，编号，按表1操作。

(单位: mL) 摇匀后再加⼊ 3,5-⼆硝基⽔杨酸 1mL，摇匀，在沸⽔浴中准确保温5分钟，取出冷却，⽤蒸馏⽔稀释到 15mL，混匀，⽤分光光度计在 520nm 波长下进⾏⽐⾊，记录消光值。以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。(2)样品的测定

取以上酶活性测定中作⽤后各管中的溶液各 1mL，分别放⼊ 15 亳升具塞刻度试管中，再加⼊ 1mL3, 5-⼆硝基⽔杨酸试剂混匀，与标准曲线管⼀起置于沸⽔浴中准确加热 5 分钟，取出冷却，⽤蒸馏⽔稀释⾄ 15mL，混匀，⽤分光光度计在 520nm 波度下进⾏⽐⾊，记录消光值，根据标准曲线，进⾏结果计算。

五、数据整理及结果计算

图 1.麦芽糖浓度与对应 OD520

由图可知标准曲线⽅程为y=8.9413x

将α测定管、α对照管、总酶测定管、总酶对照管的OD520均值分别代⼊⽅程中可求得

A=0.0333，A’=0.0295，B=0.0293，B’=0.0105

由公式：

α-淀粉酶活性(毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1)=[(A-A)*样品稀释总体积]/[样品重(g)*5] =[(0.0333-0.0295)*400*15]/[2*5]=2.28

(α-+β-)淀粉酶总活性(毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1)=[(B-B’)*样品稀释总体积]/[样品重(g)*5]=[(0.0293-

0.0105)*8000*15]/[2*5]=225.6

其中：A—α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度

A’—α-淀粉酶对照管中的麦芽糖的浓度

B—α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度

B’—α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽解浓度

相对极差：A：(0.304-0.292)/0.298=0.040

A’：(0.266-0.262)/0.2=0.015

B：(0.263-0.261)/0.262=0.008

B’：(0.096-0.093)/0.094=0.032

六、结果分析及结论

1.结果分析：通过以上对淀粉酶活性的测定，发现（α-+β-）淀粉酶总活性远⾼于α-淀粉酶活性,⼤约为100倍。⽽α-淀粉酶活性与（α-+β-）淀粉酶活性差距极⼤很可能是因为酶的协助作⽤，或是⼀部分有协助分解淀粉作⽤的酶在70℃时与β-淀粉酶⼀同失活。

2.结论：⼩麦α淀粉酶活为 0.152，总酶活为15.04。相对极差 A,B<0.05，平⾏数据之间的误差在允许的范围之内，说明 3,5-⼆硝基⽔杨酸法测定⽣成麦芽糖的浓度是可⾏的。查阅资料发现⼩麦α-淀粉酶活为50.83，总酶活459.50，与实验结果较为相近。

七、思考题:

1.从你们组酶活测定的实验结果判断本次实验设计的酶活测定样品稀释倍数是否合理? 为什么?

答：合理。朗伯-⽐尔定律的适⽤范围：吸光度在 0.2-0.8 的范围内，这样测量才准确。

2.为什么 3, 5-⼆硝基⽔杨酸与还原糖的反应要先沸⽔浴然后再稀释测定?

答：还原糖和碱性⼆硝基⽔杨酸试剂⼀起共热，产⽣⼀种棕红⾊的氨基化合物。因此在沸⽔浴时，溶液浓度越⼤反应越完全。⽽在⽐⾊法测定时，浓度过⼤⽆法测定，因此需要稀释以后进⾏测定，使数据尽可能符合朗伯-⽐尔定律：吸光度在 0.2-0.8 之间。

3.在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的⼩量变化不敏感，具体数理要求为：在底物浓度有 10%的变化幅度范围内，⽽所测初速度的变化幅度⼩于 1%。则 [S]/KM 应该⼤于多少才能保证这⼀点? (设定为⽶⽒酶)

答：根据⽶⽒⽅程：v=(Vmax[S])/(KM+[S])，根据题意：0.9[S]≤[S']≤1.1[S]，则0.99v≤v'≤1.01v,计算可得：[S]/KM＞8.18。

4.实验中对β-淀粉酶的钝化是利⽤其不耐热的特点，热钝化后冰浴骤冷，实验结果是否证实β-淀粉酶的确未复性?为什么热钝化后需要骤冷才能保证不复性?没有骤冷会怎样?为什么?

答：(1)是。因为α淀粉酶活性与全酶活性有明显差距。

(2)通过剧烈的温差改变β-淀粉酶的结构，使酶失活。

(3)没有骤冷会使蛋⽩质复性，β-淀粉酶也参与反应，测得α-淀粉酶活性偏⼤。【6】5.众多测定淀粉酶活⼒的实验设计中⼀般均采取钝化β-淀粉酶的活⼒⽽测α-淀粉酶和测总酶活⼒的策略，为何不采取钝化α-淀粉酶活⼒去测β-淀粉酶活⼒呢?这种设计思路说明什么?

答：(1)原因:

①α-淀粉酶和β-淀粉酶的催化特性是有差异的。β-淀粉酶主要作⽤于直链淀粉的α-1, 4 糖苷键，⽽且仅从淀粉分⼦外围的⾮还原性末端开始，切断⾄α-1,6 键的前⾯反应就停⽌了；⽽α-淀粉酶则⽆差别地作⽤于直链淀粉与⽀链淀粉的α-1, 4 糖苷键，所以β-淀粉酶需要α-淀粉酶淀粉⽀链的α-1, 4 糖苷键作⽤后才能完全体现其催化能⼒。

②实验中温度⽐酸度更易控制，钝化α-淀粉酶难度远远⾼于β-淀粉酶。

③若提⾼酸度钝化α-淀粉酶，则回调最适 pH 时α-淀粉酶也有可能由于恢复活⼒。

(2)这种设计思路说明：在测定酶的⽐活⼒时，要综合考虑各种可能出现的酶的性质以及它们之间的联系，也要考虑到实验操作的可⾏性。【6】

6. 我们所测定得到的总酶活⼒减去所测定得到的α-淀粉酶活⼒是否就等于β-淀粉酶活⼒? 为什么?

答：不等于。因为酶之间是有机结合的协同作⽤，⽽不是简单叠加。同时，因为β-淀粉酶和α-淀粉酶作⽤于α-1,4 糖苷键，但⼆者不能⽔解⽀链的α-1,6 糖苷键。⽽我们所测定的总酶活⼒是⼆者与 R 酶共同作⽤下测得的酶活⼒（R 酶能够降解⽀链淀粉，断裂

α-1,6 糖苷键，从⽽增⼤β淀粉酶和α淀粉酶可⽔解的底物浓度），使测得的总活⼒⼤于β淀粉酶和α淀粉酶单独作⽤的酶活⼒之和。【6】

7.酶的最适反应温度和酶的最适保存温度是⼀样的吗? 为什么?

答：不⼀样。最适反应温度时，酶的结构最适合诱导底物与之结合形成酶-底物复合物，因此体现出酶的活性最强。⽽在最适保存温度时，酶的稳定性最好，催化能⼒很低，从⽽很好地保存了酶的活性。这两个状态都是需要维护酶的空间结构，但最适反应温度略⾼于最适保存温度。【13】【14】

8.本实验中设计的对照管与⽐⾊法测定物质含量实验中设计的空⽩管有何异同?本实验可否⽤对照管调分光光度计的 100%T ?为什么?

答：(1)两种都是为了消除⾮测定部分对光的吸收，空⽩组是为了消除溶液中溶剂等其他组分对光的吸收，⽽对照组是为了消除麦芽中⾃⾝已经存在的麦芽糖对实验结果的影响。

(2)不可。因为标准曲线是建⽴在空⽩基础上的，⽽对照组已经存在⼀部分⼩麦萌发过程中形成的麦芽糖，会导致实验结果偏⼤。

9.在⽣物化学研究中，常常需要使⽤缓冲液?为什么?在使⽤缓冲液时应注意哪些问题?

答：（1）⽣物化学研究对象⽣物⼤分⼦多为两性物质，如蛋⽩质、核酸等。它们某些集团的解离状态受到 pH 的影响，从⽽导致性质和功能受到影响。同时，⽣物⼤分⼦来⾃⽣物体内，过酸或者过碱的环境都容易使其失活。缓冲液具有维持和稳定pH 的特性，所以常选⽤缓冲液。【15】

（2）注意根据⽬标物特性选择合适的缓冲范围；缓冲液不能和待测组分相互作⽤或发⽣反应；缓冲组分的浓度为 1:1；有⾜够的缓冲容量。

⼋、总结

1、本实验某些步骤易产⽣较⼤误差：①70℃或15min时间控制不严格可能导致β-淀粉酶未完全钝化使得测定活性偏⼤；

②70℃⽔浴后需要⽴即冰浴，否则β-淀粉酶复性使测得的α-淀粉酶活性偏⼤；

③向测定管中加⼊ NaOH 应迅速，否则酶与底物继续反应使结果偏⼤。

2、测定过程中需要沸⽔浴，应当按顺序摆放⾃⼰的试管，防⽌不⼩⼼拿错。

3、酶具有极⾼的催化效率，因此需要注意反应的同时性。微⼩的时间差会在平⾏数据间带来巨⼤误差。可以考虑两⼈配合来保证其同时性。

4、实验材料的取材部位和⽣长条件不同，每种测定⽅法的灵敏度不同，使得蛋⽩含量差异⼤。【6】

九、参考⽂献

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