CAR-T细胞制备整理

文献来源一：

“Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood”作者：M. Helen Huls 1.

1、制备：

1）采集样本后，制备分离，首先用PBS进行外周血等体积，脐血四倍体积稀释。

2）将稀释后的血，50ml的量加到装有12ml分离液的50ml离心管中,400g离心30-40min.

3） 收集白膜层单个核细胞到新的50ml离心管当中，加入PBS定容到50ml，450g离心10min.

4）去除上清，重悬细胞沉淀用50ml完全培养基，然后400g,离心10min.

5）去上清，细胞继续用完全培养基重悬，然后胎盼蓝细胞计数。

6）MNC细胞用于电穿孔核转染载体或者冻存备用。

2、预处理

A、如使用冷冻保存的MNC，在37度条件下迅速解冻细胞进行全面的电穿孔(2 x 10^8+20%，以计算细胞损失在离心及2h孵育过程中)。如使用新分离制备MNC，则按照2.3操作进行。

B、温和地重悬细胞并且转移到适当大小的离心管中，离心管中预先添加的完全的无酚RPMI培养液。200g离心10min，去上清。

C、用PF-RPMI重悬MNC，取样进行细胞计数，按10^6/ml的密度接种到合适的培养容器中。

D、在37度条件下，5%CO2,孵育2h。

E、将MNC转移到无菌的离心管中，200g旋转5分钟，去上清，然后用PF-RPMI温和的重悬细胞沉淀。

F、计数细胞，并且定容，细胞要求为2*10^8.

G、将细胞悬液转移到无菌50ml的离心管上，200 g旋转10min。

H、去上清，温和的重悬细胞。

3、电穿孔细胞

4、人工抗原递呈细胞介导的刺激CAR-T细胞

 电穿孔转染后的细胞（表达CAR），在无菌容器中γ辅射处理后的aAPC细胞按1：2与CAR+细胞在完全培养基中混合，添加IL-21(30ng/ml),分装至T75培养瓶或者培养袋中，接种量为10^6/ml，细胞进行培养。

5、CAR-T细胞的培养

 半量换液，补充添加IL-21,维持细胞密度为10^6/ml.

文献来源二：

“特异性人工抗原提呈细胞体外激活 CD 19 嵌合抗原受体T T 细胞的构建” 作者：彭耀军

制备：

1）慢病毒载体的构建；

2）慢病毒包装及转染；

3）CD19CAR结构及CAR-T细胞制备：采用Ficoll淋巴细胞分离液分离获得健康人外周血单核细胞（PBMC），在24孔板中培养，同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠（Invitrogen公司）刺激PBMC，24 h及48 h后加入CD19CAR病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2（300 U/ml），CAR-T 细胞扩增至第 6 或 7 天后检测CAR基因表达及用于后续实验。