农杆菌感受态细胞的制备方法

［目的及要求］

了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

［实验原理］

在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株

三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

利福平（Rif）储液：50mg/ml

20mM CaCl2，高压灭菌。

［实验步骤］

1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；

2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；

3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；

4、加入1000µl 20mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；

5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。

实验二  质粒DNA直接导入农杆菌

［目的及要求］

了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法，获得能用于植物转化的工程菌。

［实验原理］

在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。

植物真核表达载体pCAMBIA1300图谱

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，-70℃超低温冰箱，培养皿，微量进样器及吸头。

材料：根癌农杆菌LBA4404（或EHA105）感受态细胞，质粒pCAMBAI1300+SPR植物表达载体

二、试剂：液氮

YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4•7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

YEB固体培养基：每升YEB液体培养基加15g琼脂粉，高压灭菌。

卡那霉素（Kan）储液：50mg/ml

利福平（Rif）储液：50mg/ml

YEB固体培养基平板（Kan抗性）：灭菌后的YEB固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度分别为100µg/ml和50µg/ml，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。

［实验步骤］

1、在200µl感受态细胞中加入2－6µl质粒（pBI121）DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min；

2、迅速转入37℃水浴中，热激5min；

3、加入1ml YEB液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时；

4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200µl菌液涂布于含有50µg/ml Kan和50µg/ml Rif的YEB平板；

5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。

实验三  农杆菌转化子的鉴定

［目的及要求］

掌握农杆菌质粒DNA的提取方法。将从农杆菌提取的质粒与对照质粒同时电泳，通过比较确定获得了农杆菌转化子。

［实验原理］

经改造的Ti质粒（只含有帮助T-DNA跳到植物染色体上的Vir区）存在于农杆菌工程菌株中，含有T-DNA的双元载体（Binory Vectors）完成重组后可以在大肠杆菌中扩增，再转入农杆菌中。从抗性培养基上筛选得到的农杆菌转化子中应携带转入的重组质粒，而对照菌株则没有。

碱裂解法是一种应用最为广泛的质粒DNA提取方法，该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而使其分离。当细胞在NaOH 和SDS溶液中裂解时，在pH高达12.6的碱性条件下，蛋白质和染色体DNA发生变性，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋结构解开，而质粒DNA虽大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当加入中和液醋酸钾或醋酸钠高盐缓冲液时，质粒DNA恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物随细胞碎片等沉淀下来，质粒DNA则留在上清中。

［实验仪器、材料和试剂］

一、仪器：台式高速离心机，高压灭菌锅，恒温摇床，恒温水浴，电泳仪及电泳槽，紫外灯，加样器（pipettor），小离心管（eppendorf tube），吸头（tip），三角瓶，牙签。

二、材料：含质粒的农杆菌LBA4404（或EHA105），农杆菌LBA4404或EHA105）

三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）

10mmol/L EDTA（pH8.0），高压灭菌（6.5×104Pa），4℃保存

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH ，1％ SDS 

先分别配成浓度0.4M NaOH（灭菌）及2％ SDS，用前等体积混合。

溶液Ⅲ：3mol/L NaAc/KAc（pH4.8）10

5mol/L NaAc/KAc 60ml（灭菌）

HAc 11.5ml 

H2O 28.5ml（灭菌），三者混合

      　EB：贮液浓度为10mg/mL，工作浓度为0.5µg/ml

TAE：40mmol/L Tris-HAc，2mmol/L EDTA，pH8.0，Tris饱和酚、氯仿、无水乙醇、RNase A

［实验步骤］

1、质粒DNA的提取

（1）挑取一个单菌落接种于3ml含相应抗生素的YEB（50mg/L Km）液体培养基中，28℃剧烈振荡过夜； 

（2）收集1.5ml过夜培养物于1.5ml离心管中，10000rpm离心30sec收集菌体，尽可能除尽培养基；

（3）向细胞沉淀中加入100µl 预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡，使菌体充分悬浮；

（4）加入200μl 溶液Ⅱ，立即温和颠倒离心管4-10次，避免剧烈振荡；

（5）加入150μl 溶液Ⅲ，温和颠倒离心管4-10次，将离心管置冰浴5min；

（6）于室温12000g离心15min，将上清液转入新的离心管中（尽量避免吸取沉淀）；

（7）加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀；

（8）12000g离心10min，弃上清液，加入400μl 70%乙醇，12000g离心8min，弃上清，在真空抽干或在超净工作台中吹干；

（9）加入10µl含20µg/ml RNase A的TE或重蒸水溶解DNA，37°C温育30min；

（10）-20℃保存。

2、用琼脂糖电泳检测质粒DNA（或用PCR进行检测）

用1×TAE配制0.8％的琼脂糖凝胶，取所提取的质粒DNA溶液2-5µl进行电泳，50-100v约0.5-1hr，紫外灯下观察结果。

实验四 烟草遗传转化实验

[实验目的与意义]

烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。

[实验器材]

摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。

[实验药品]

MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、无菌水、6-BA、NAA、0.1%升汞、70%乙醇。

烟草愈伤诱导或分化培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)

烟草生根培养基：MS+ NAA(0.1mg/L)

烟草选择培养基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)+75mg/L Km+500mg/L羧卞青霉素（Cb）

[实验步骤]

1.受体材料的准备与预培养

（1）取自田间栽培烟草植株，用蒸馏水冲洗1遍后，以70%乙醇清洗45s，再以0.1%的升汞消毒6-8min，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）用灭过菌的打孔器将无菌烟草叶片凿成6mm的叶盘（或用手术刀切成5－10mm方形叶片。

（3）将叶盘或叶片接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，预培养2－3天，材料切口处刚刚开始彭大时备用。

2.根癌农杆菌培养

（1）从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（卡那霉素）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。

（2）OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素的YEB液体培养基中，可同时加入100~500µmol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。

3.浸染

在超净工作台上，将菌液倒入无菌三角瓶中，从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（5~30min）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

4.共培养

将浸染过的外植体接种在烟草愈伤组织诱导或分化培养基上，在28℃暗培养条件下共培养2~4天。

5.选择培养

将经过共培养的外植体移到加有选择压的烟草愈伤组织诱导或分化培养基（附加500mg/L的羧苄青霉素，抑制根癌农标菌生长）上，在光照为2000~10000lx、25℃条件下进行选择培养。

6.继代选择培养

选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中使其生长或诱导生化。

7.生根培养

待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的烟草生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。

附YEP可用LB培养基替代，配方如下：

LB固体培养基和LB液体培养基

    酵母提取物(yeast Ext)              5g/L

    蛋白冻(peptone)                   10g/L

        NaCl                        10g/L

液体LB培养基不含琼脂，供摇床培养农杆菌，含0.5%琼脂的固体供短期保存菌种用。(pH7.0-7.2)