表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究

及其免疫保护性研究

乔传玲1,2,于康震1,2,姜永萍1,2,张建林1,2,邓国华1,2,

孟庆文1,2,田国斌2,唐秀英2

(1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;2农业部动物流感研究中心,哈尔滨　150001)

摘要:从含有禽流感病毒A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)核蛋白(NP )基因的质粒pUC NP 中切下NP 基因片段,将其亚克隆到pSY 538质粒,再将带有痘苗病毒启动子P11的Lac Z 基因也平端克隆到pSY 538质粒,然后切下同时含有NP 及Lac Z 基因的片段,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY 681,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY (NP +Lac Z )。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S 2FPV 2017的鸡胚成纤维细胞,在X 2gal 存在的条件下,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR 、Western 2blot 鉴定,结果证明,获得了能高效表达

AI V NP 蛋白的重组禽痘病毒rFPV 2NP 。SPF 鸡体内的免疫保护试验结果表明,它能够诱导机体产生较高水平的NP

特异性抗体,并对H5N1和H7N1这2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。

关键词:禽流感病毒;重组禽痘病毒;核蛋白基因;免疫保护性

Protection and Construction of Recombinant Fowlpox Virus Expre ssing

Nucleoprotein Gene of Avian Influenza Virus

QI AO Chuan 2ling 1,2,Y U K ang 2zhen 1,2,J I ANG Y ong 2ping 1,2,ZH ANGJian 2lin 1,2,DE NG G uo 2hua 1,2,

ME NG Qing 2wen 1,2,TI AN G uo 2bin 2,T ANG X iu 2ying 2

(1National K ey Laboratory o f Veterinary Biotechnology/Harbin Veterinary Research Institute ,Chinese Academy o f

Agricultural Sciences ;2Research Certer o f Animal Influenza ,Ministry o f Agriculture ,Harbin 150001)

Abstract :T o construct trans fer vector ,NP gene of A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1),which derived from recom 2binant plasmid pUC NP ,was subcloned into EcoRI site of pSY 538,and Lac Z gene prom oted by p11was cloned into SmaI site of this plasmid.Both NP and Lac Z gene were cloned into NotI site of FPV vector pSY 681.Then it was trans ferred onto CEF cells in fected with S 2FPV 2017.F owlpox virus recombinants were selected by blue plaque screening with X 2gal following several cycles purification.The results of identification by PCR and Western 2blot indicated that recombinant FPV could efficiently express NP gene of AI V in vitro.The results of immunization in SPF chickens indicated that this re 2combinant virus could induce high titer NP specific antibodies and protect chickens against the lethal challenge with H5N1and H7N1HPAI V.

K ey words :Avian In fluenza ;Recombinant fowlpox virus ;NP gene ;Protection

收稿日期:2001211227

作者简介:乔传玲(19732),女,河南宁陵人,博士,主要从事动物病毒分子生物学研究。于康震为通讯作者,现在农业部畜牧兽医局工作。T el :

010*********;E 2mail :yutian @mail.agri.g ov.cn

　　禽流感(AI )是由正粘病毒科、A 型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征,该病于1878

年在意大利鸡群中首次暴发,目前已遍布于世界上许多国家和地区,被国际兽疫局列为A 类烈性传染

病。近几年来,在我国的一些地区也相继分离到了不同亚型的禽流感病毒,禽流感使养禽业遭受很大的经济损失[1]。特别是1997年禽流感感染人的事件更加引起了世人的震惊,它预示着该病不仅

中国农业科学　2003,36(6):704-708Scientia Agricultura S inica

就AI V而言,具有免疫保护性的几种蛋白主要是H A、NA及NP,其中H A、NA可诱导机体产生中和抗体,为体液免疫的主要靶抗原,它们是亚型特异性的。NP可诱导机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CT L)反应,为细胞免疫的靶抗原,在不同亚型之间可产生交叉保护性[2]。据报道,基于H A基因的活载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗均可对同一H A亚型病毒的攻击产生近100%的保护,而对其它亚型病毒攻击的保护性较差[3～7]。近几年来,禽痘病毒作为重组病毒载体疫苗株之一以其独到的优越性,已成功用于多种病原基因的表达[8～10],本研究的目的是将AI V主要保护性抗原NP基因插入禽痘病毒(FPV)转移载体中,然后再转染由亲本禽痘病毒S2FPV2017所感染的CEF细胞,获得表达禽流感病毒NP基因的重组禽痘病毒(rFPV2NP),并进一步探讨其对SPF鸡的免疫保护性。

1　材料与方法

1.1　质粒

pUC NP是含有H5亚型禽流感病毒A/G oose/ G uangdong/1/96(H5N1)株NP基因完整cDNA的重组质粒,基因两端引入了EcoRI位点,由本实验室保存。pSY538含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2, pSY681含有禽痘病毒同源臂,pSC11含有痘苗病毒启动子P11启动的Lac Z基因,它们均由美国加利福尼亚大学Y ilma教授惠赠。

1.2　病毒

禽痘病毒S2FPV2017由美国加利福尼亚大学Y ilma教授惠赠。攻毒用高致病力禽流感病毒(HPAI V)A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)和K P株H7N1病毒由动物流感研究中心保存。

1.3　实验动物

8周龄SPF鸡由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供,试验期间饲养于禽病感染实验室的负压隔离器中。

1.4　含NP基因重组禽痘病毒转移载体的构建

首先用性内切酶EcoRI将NP基因从pUC2 NP上切下,直接克隆到pSY538的EcoRI位点,筛选正向插入的重组质粒;用PstI及XbaI消化质粒pSC11,回收大小约为3.2kb的片段,T4DNA聚合酶末端补平后克隆到pSY538的SmaI位点;然后再将同时含有NP及Lac Z基因的片段切下克隆到质粒pSY681的NotI位点,从而构建出以大肠杆菌Lac Z 基因作为报告基因的禽流感病毒NP基因重组禽痘病毒转移载体。

1.5　转染与筛选

按常规方法制备鸡胚成纤维(CEF)细胞,待其长成单层后接种禽痘病毒S2FPV2017,37℃作用2h,用不含抗生素的Hanks液洗2次,按照Lipofec2 tamineT M P LUS试剂盒使用说明书将重组质粒转染细胞,作用2h后,更换含2倍血清的培养基,待80%以上的细胞出现病变时收获,留作种毒备用。筛选重组病毒时将种毒作10倍倍比稀释后接种于CEF细胞,感作2h后在其表面铺制第一层琼脂糖凝胶,出现细胞病变后,再铺制含有X2gal(200μg・ml-1)的低熔点琼脂糖凝胶。

1.6　重组病毒的鉴定

1.6.1　PCR鉴定　采用S DS2蛋白酶K法分离和纯化重组病毒的DNA,通过PCR来验证AI V NP基因是否在其重组病毒的基因组中。

1.6.2　Western blot检测　用重组禽痘病毒rFPV2 NP、禽痘病毒亲本株S2FPV2017感染的CEF细胞及正常CEF细胞和AI V裂解后制备的样品进行S DS2 PAGE电泳,之后转移到NC膜上用AI V特异性多克隆血清进行Western blot检测重组禽痘病毒所表达的AI V NP蛋白。

1.7　免疫保护试验

1.7.1　免疫　将8周龄SPF鸡随机分为3组,每组20只。第1组为空白对照,不作任何处理。第2组为禽痘病毒免疫组,经翅膀刺种途径接种FPV细胞培养液,病毒含量为

2.5×105pfu[6]。第3组为重组禽痘病毒免疫组,翅下刺种5×105pfu的rFPV2NP细胞培养液。

1.7.2　攻毒　免疫后4周将各组免疫鸡一分为二,分别用10倍鸡体半数致死量(10LD50)的A/G oose/ G uangdong/1/96(H5N1)和K P株H7N12个HPAI V 毒株进行攻击。

1.7.3　抗体检测　免疫和攻毒后每周采血分离血清,用杆状病毒表达的NP抗原纯化后作为E LIS A 抗原,间接法检测NP特异性抗体。

1.7.4　病毒分离　于攻毒后第4天采集泄殖腔拭子,经抗生素处理,尿囊腔接种于9～11日龄的SPF 鸡胚,1个样品接种3枚鸡胚,每枚0.2ml,收集接种24h后死亡鸡胚的尿囊液,微量血凝试验检测病毒

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6期　　　　　　　　乔传玲等:表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究　　　　　　　　

的存在。第1次检测结果为阴性的样品,要进行3

次盲传后方可判定结果。

1.7.5　统计发病率和死亡率　攻毒后两周内每天

观察试验鸡的生长状况,并详细记录发病和死亡情况。临床发病的判定标准为:鸡群中个别鸡表现呆立、对外界刺激反应不灵敏,头下垂、眼睛呈全闭或半闭状态、羽毛杂乱等;眼观病变有流鼻涕和眼泪、无毛部位皮肤发绀、出血、水肿,鸡冠肉髯坏死。

2　结果与分析

2.1　表达AI V NP 基因重组禽痘病毒的构建2.1.1　转移载体的构建　所构建的重组转移载体

同时插入了NP 和Lac Z 基因,其大小约为10.5kb ,当性内切酶HindIII 消化可切出5.2kb 和5.3kb 大小的2个带(line 3、4、5),而用XhoI 则切出3.3kb 和7.2kb 2条带(line 2),酶切鉴定的结果表明这2个基因的表达方向相同(图1)

。

1:λDNA/EcoRI +H indIII 2:pSY (NP +Lac Z )/XhoI 3、4、5:pSY (NP +Lac Z )/H indIII

图1　p SY (NP +LacZ )转移载体酶切鉴定

Fig.1　Restriction enzyme analysis of trans fer vector pSY (NP +

Lac Z )

2.1.2　重组禽痘病毒的筛选与纯化　经2次铺胶

后,筛选到的第一代重组病毒在CEF 细胞上形成蓝

斑。进一步克隆纯化后重组病毒在CEF 细胞上所形成的蚀斑100%为蓝斑。

2.1.3　重组病毒的鉴定　PCR 提取其病毒DNA ,PCR 扩增出一条长短约为1.5kb 的条带(图2),

证

1:NP PCR product 2:Negative control 3:D L2000DNA M arker

图2　rFPV 2NP 重组病毒PCR 鉴定

Fig.2　Identification of the recombinant rFPV 2NP by PCR

明NP 基因已重组到禽痘病毒基因组中。

NP 蛋白在重组禽痘病毒中的表达,用禽流感病毒的特异性血清进行Western blot 分析,结果检测到NP 蛋白大小为56ku ,具有与AI V 蛋白一样的生物学活性(图3)。2.2　重组病毒rFPV 2NP 的免疫保护性2.2.1　抗体　E LIS A 抗体检测结果为重组禽痘病

毒免疫组的抗体水平远远高于禽痘病毒免疫组和空

1:低分子量蛋白标准Low m olecular weight protein M arker 2、3:rFPV 2NP 感染的CEF 细胞CEF cells in fected with rFPV 2NP 4:S 2FPV 2107感染的CEF 细胞CEF cells in fected with S 2FPV 21075:AIV 对照AIV control

图3　重组病毒NP 基因表达产物We stern 2blot 检测

Fig.3　Western 2blot analysis of NP protein expressedby recombi 2

nant virus

6

07　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　农　业　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　36卷

白对照组,并且免疫鸡在攻毒后1周抗体水平显著升高(图4)

。

图4　试验鸡在免疫和攻毒后NP 2E LISA 抗体的变化

Fig.4　E LIS A antibody to NP of chickens after immunization and

challenge

2.2.2　病毒分离　NP 重组禽痘病毒免疫组在用H5N1和H7N1病毒攻击后第4天,存活的免疫鸡泄

殖腔中病毒的检出率为分别为3/10(30%)和2/6(33.3%),而亲本禽痘病毒S 2FPV 2017免疫组和非免疫对照组所采样品检测结果均为阳性(表)。2.2.3　发病和死亡情况　NP 重组禽痘病毒免疫组当用H5N1毒株进行攻击时,有7只发病,6只死亡;而当用异源毒株H7N1攻击时,有8只发病,7只死亡。禽痘病毒免疫组和空白对照组则全部发病和死亡(表)。

3　讨论与结论

随着DNA 重组技术的发展和应用,目前疫苗研究已逐步从常规疫苗向基因工程疫苗过渡。在美国已经研制出了表达H5亚型AI V H A 基因的重组禽痘病毒,可以对同一H A 亚型病毒的侵染产生100%

表　SPF 鸡用致死剂量的HPAI V H 5N 1和H 7N 1攻毒保护结果1)

T able 　Protection of immunized chickens against lethal challenge with HPAI V H5N1and H7N1组别

G roups

攻毒后天数

Days post 2challenge (d )

12345678鸡总数

T otal N o.阳性检出/样品总数

N o.positive/N o.tested

保护率

Protection rate

(%)

非免疫对照

H5N1

0/00/06/05/34/32/20/20/0107/70Unvaccinated control H7N10/07/32/50/20/010-2)0S 2FPV 2017免疫

H5N10/00/05/06/25/33/20/30/0108/80S 2FPV 2017immunized H7N10/06/25/31/40/10/0101/13)0rFPV 2NP 免疫

H5N10/00/00/05/04/23/20/10/0103/1040rFPV 2NP immunized

H7N1

0/0

4/0

4/2

4/2

2/2

1/1

0/0

0/0

10

2/6

30

1)

　斜线‘/’上方为发病鸡数,下方为死亡鸡数;2)该组鸡在攻毒的第四天已全部死亡;3)仅有1只鸡存活1)　‘/’upper is N o.of sick chicken ,downer is N o.of dead chicken ;2)The chickens were all died 4days post 2challenge ;3)Only one chicken is surviving

的免疫保护。1998年,重组禽痘病毒疫苗已获得美国农业部的批准可在紧急情况下使用,并于同年在墨西哥的商品肉鸡群中应用,从而有效地控制了H5N2的流行[11]。鉴于禽流感病毒是变异最快、亚型最多的一种病原,仅其表面的2种抗原H A 和NA 的变异就会导致病毒得以逃避宿主免疫系统的监视,所以说一种理想的禽流感疫苗必须能够对更多亚型禽流感病毒的攻击提供保护。尽管针对病毒H A 蛋白已经研制了各种类型的疫苗,但它们的保护效力也仅仅限于同一H A 亚型之间的病毒攻击,而对另一不同亚型病毒的攻击则没有保护作用。NP 蛋白作为病毒最为保守的蛋白,它能否提供更好的免疫保护性,一直是人们研究的热点[12～14]。

本试验将已进行测序的禽流感病毒A/G oose/G uangdong/1/96(H5N1)的NP 基因亚克隆到禽痘病毒转移载体中,构建转移质粒、继而转染由禽痘病毒

亲本株感染的CEF 细胞,筛选到的重组病毒经体内

外试验进一步鉴定证实能够高效表达具有AI V 蛋白相同生物学活性的NP 蛋白,表达产物约为56ku ,与杆状病毒表达的NP 蛋白具有相同的分子量[15]。为了进一步检测所表达的NP 蛋白在机体内能否诱导保护性免疫反应的产生,将它接种于8周龄SPF 鸡后,用H5N1和H7N12种亚型的HPAI V 进行致死性攻击,结果其保护率分别为40%和30%,进一步证实单个的NP 蛋白在体内所诱导的免疫原性还不足以对致死性攻击提供强有力的保护,这一结果与有关的文献报道相符[5]。

在本动物试验的各组免疫鸡中都放入了2只空白对照鸡,当用致死剂量的HPAI V 对免疫鸡进行攻击后,尽管从部分重组病毒免疫鸡的泄殖腔中分离到了病毒,其中的对照鸡并没有感染和发病;与此相反,亲本禽痘病毒免疫组中的对照鸡全部感染、发病

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076期　　　　　　　　乔传玲等:表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究　　　　　　　　

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(责任编辑　林鉴非)

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