氨基葡萄糖和硫酸软骨素联合用药对兔骨关节炎治疗作用的实验研究

傅欣1  林霖1  魏学磊1  侯宇1  张继英1  王锦程2  于长隆1

1 北京大学第三医院运动医学研究所（北京100083）

2 河北省唐山市容大药业有限公司

摘要 目的：观察氨基葡萄糖(GS)和硫酸软骨素(CS)对兔骨关节炎不同时期关节软骨退变和关节液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响，初步探讨GS和CS对兔骨关节炎治疗作用的机制。方法：45只成年新西兰大白兔，随机分为5组，分别为低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、阴性对照组，每组9只（18个膝关节）。采用内侧副韧带切断术和内侧半月板切除术建立骨性关节炎模型，术后次日即进行动物的药物灌胃，每日1次，每组动物分别于灌胃后1周、2周、3周取材。阳性对照组灌胃用等剂量的蒸馏水。采用墨汁染色的方法大体观察软骨损伤情况，使用光镜观察关节软骨组织学的变化;采用酶联免疫吸附法测定关节液中IL-1β和TNF-α表达。结果：墨汁染色法和软骨组织学显示在1周和2周时，低、中、高剂量组与阳性对照组之间均有显著性差异（P<0.05）。低、中、高剂量组之间无显著性差异（P>0.05）。在3周时，低、中、高剂量组与阳性对照组之间均有显著性差异（P<0.05）。中、高剂量组之间无显著性差异（P>0.05）。低、高剂量组之间有显著性差异（P<0.05）。术后1、2、3周，各治疗组关节液中炎性因子IL-1β和TNF-α均显著低于阳性对照组，但显著高于阴性对照组。结论：不同剂量的GS和CS对兔骨关节炎不同时期软骨损伤均有一定的保护和治疗作用，减少关节液中炎性因子IL-1β和TNF-α的表达，可以较好地延缓OA的进展。

关键词  氨基葡萄糖；硫酸软骨素；骨关节炎；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子α

基金项目：本课题得到国家体育总局基因治疗创伤性骨性关节炎项目基金资助

责任作者：于长隆，YCL123@vip.sina.com

Application of Glucosamine and Chondroitinsulfate in the Treatment of the Knee Joint with Osteoarthtitis in Rabbit Model

Fu Xin1，Lin lin1，Wei Xuelei1，Hou Yu1，Zhang Jiying1，Wang Jincheng2，Yu Changlong1

1 Institute of Sports Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing, China 100083

2 TangShan RongDa Pharmaceutical Co., Ltd , Tangshan, China 063020

Abstract  Objective To study the effect of glucosamine (GS) and chondroitin sulfate (CS) on the injury of cartilage and the expression of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) of the knee joint with osteoarthritis in rabbit model. Methods 45 rabbits were randomly divided into 5 groups (9 in each group): negative control group, positive control group, low dose group, moderate dose group and high dose group. Transection of the medial collateral ligament and medial meniscectomy of both knees were performed. The 2th day post-operation, GS and CS were taken by intragastric administration in treatment group, and rabbits were treated with distilled water in positive control group. After continuous treatment, the animals were sacrificed on week 1, 2 and 3. The cartilage was stained with Indian ink to evaluate the severity of cartilage injury. Light microscope was used to investigate the morphological change of cartilage. The expression of cytokines such as IL-1β and TNF-α in synovial fluid was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Ink staining and light microscope revealed that the cartilage of knee joint showed slight degeneration on week 1, 2 and 3 in the 3 treatment group compared with that in positive control group respectively. On week 3, the injury of cartilage in high dose group was less than that in the low dose group, and there was no significant difference between high dose group and moderate dose group. The expression of IL-1β and TNF-α was significantly decreased in the 3 treatment group. Conclusion Different dose of GS and CS intake had the positive influences for slow-down the progressing of OA.

Key words glucosamine; chondroitin sulfate; osteoarthritis; interleukin-1β; tumor necrosis factor α

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是由于关节软骨的慢性退行性改变导致的关节疼痛和畸形，从而产生活动障碍。在运动员中,因长期专项训练对膝关节关节软骨的应力劳损，使膝关节骨关节炎发病率比相同年龄组的普通人群高，髌骨软骨病和髌股关节软骨软化症的发生率占所有膝关节运动损伤的40.48%[1] 。严重影响了许多运动员的训练和比赛成绩的提高。

目前治疗骨关节炎的药物多数仅为缓解症状，对导致OA的病理过程，即关节软骨的代谢障碍作用较小。抗炎和镇痛药物是治疗骨关节炎最常使用的药物，虽然有报道阿司匹林有抑制骨性关节炎发展的作用，但是这一类药物的主要作用还是通过减轻疾病的疼痛来实现的。已有证据表明，口服水杨酸制剂可使骨关节炎患者的关节软骨蛋白多糖和透明质酸的合成减少，关节软骨易发生表面纤维化，反而使骨关节炎的病理损伤加重[2]。近年来一些研究发现对骨关节炎更合理的治疗是应用关节软骨保护剂，它不仅能刺激软骨组织合成蛋白多糖和胶原蛋白，抑制胶原酶和蛋白多糖降解酶的活性，还能减少关节软骨形态学的改变[3]。氨基葡萄糖(glucosamine，GS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一类天然的氨基葡聚糖，广泛存在于人和动物软骨、肌腱和韧带中，为关节软骨的主要组分[4]。本实验通过建立兔膝关节OA模型，观察GS和CS对OA软骨退变和关节液中炎性因子白细胞介素-1β (Interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达的影响，初步探讨GS和CS对兔OA治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型制作

45只成年新西兰大白兔（90个膝关节），体重为2.5kg～3kg，由北京大学医学部动物部提供。动物随机分为5组，分别为低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、阴性对照组，每组9只（18个膝关节）。低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组的每只兔均在两侧关节施行手术。经耳缘静脉注射20﹪乌拉坦(5ml/kg)对兔进行全身麻醉，无菌条件下行膝内侧髌骨旁切口，仔细解剖内侧副韧带，切断并切除内侧副韧带长约0.5cm；打开关节腔，切除内侧半月板，缝合关节腔及皮肤。阴性对照组兔每只在上述相同条件下切开皮肤和关节腔，不做韧带和半月板切除，然后缝合关节腔和皮肤。术后各组每只兔肌注40万单位青霉素，连续3天，以防膝关节感染。

1.2 动物术后的喂养

    术后次日即进行动物的药物灌胃，每日1次。根据Meeh - Rubner 公式A = K ×W2/ 3 (A为表面积/m2 值，W为体重/kg值)及相关文献[5]换算人与兔的药物摄入量。具体为低剂量组兔每日灌胃剂量为硫酸软骨素20毫克/公斤体重，氨基葡萄糖盐酸盐25毫克/公斤体重；中剂量组兔每日灌胃剂量为硫酸软骨素66毫克/公斤体重，氨基葡萄糖盐酸盐82.5毫克/公斤体重；高剂量组兔每日灌胃剂量为硫酸软骨素400毫克/公斤体重，氨基葡萄糖盐酸盐500毫克/公斤体重。各治疗组配成溶液按照每公斤体重6毫升进行灌胃。硫酸软骨素和氨基葡萄糖盐酸盐由唐山容大药业有限公司提供。阳性对照组按照每公斤体重6毫升灌胃蒸馏水。每日灌胃直至取材前。阴性对照组术后正常饲养不灌胃。

1.3 标本取材与制备

标本取材均为双膝。动物每组分别于灌胃后1、2、3周取材，每次每组各取材3只兔（6个膝关节）。麻醉后，从髌上囊部位注射入关节腔1毫升无菌PBS，反复活动关节后，仔细抽取灌洗液，做好标记后立即置于－70℃冰箱中保存备用，然后空气栓塞处死动物，切开关节腔，将游离的关节和关节囊固定于中性多聚甲醛固定液中。

1.4 观察指标

1.4.1 用墨汁染色方法观察软骨损伤情况

标本于10%多聚甲醛中固定3天后，流水冲洗12小时。内外股骨髁软骨面用蒸馏水洗净后，用滤纸轻轻擦干，用毛笔将墨汁刷于软骨表面，半分钟后，用蒸馏水将墨汁冲去，将上述过程再重复一遍。根据Yoshioka等[6]的分类标准将软骨表面的大体所见分为4级：Ⅰ级：软骨面完整，无墨汁沉积；Ⅱ级：软骨表面轻度纤维化，墨汁染色可见长条形的斑点样沉积，或淡灰色斑痕；Ⅲ级：软骨表面明显的纤维化，墨汁染色深黑色斑痕，呈天鹅绒状；Ⅳ级：软骨表面糜烂，墨汁染色见软骨缺失，暴露软骨下骨。

1.4.2 关节软骨的组织学检查

    关节软骨经过10％中性甲醛固定后，常规脱钙、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片，苏木素－伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）、甲苯胺蓝染色。

1.4.3 关节灌洗液炎性因子的检查

    采用双抗夹心ABC－ELISA（酶联免疫吸附，enzyme-linked immunosorbent assay）方法。每份关节腔灌洗液，分别取100ul进行IL-1β和TNF-α蛋白表达分析。应用美国Biosource公司提供的ELISA试剂盒，分别用抗兔IL-1β或TNF-α单抗包被于酶标板上，标准品中的兔IL-1β或TNF-α与单抗结合，加入生物素化的抗兔IL-1β或TNF-α，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记streptavidin与生物素结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，兔IL-1β或TNF-α与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中兔IL-1β或TNF-α浓度。

1.5 统计学分析

    所有数据均用SPSS 11.5进行统计分析。关节软骨墨汁染色结果用Kruskal-Wallis 秩和检验，ELISA结果用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 墨汁染色方法观察软骨损伤情况

表1显示，手术后1周时，阴性对照组股骨内髁Ⅰ级5例、Ⅱ级1例，低剂量组股骨内髁Ⅰ级2例、Ⅱ级4例，中剂量组股骨内髁Ⅰ级3例、Ⅱ级3例，高剂量组股骨内髁Ⅰ级3例、Ⅱ级3例，阳性对照组股骨内髁Ⅱ级4例、Ⅲ级2例。经Kruskal-Wallis秩和检验，低、中、高剂量组与阳性对照组之间均有显著性差异（P<0.05）。低、中、高剂量组之间无显著性差异（P>0.05）。

表1 手术后1周股骨内髁墨汁染色结果

Table 1 The results of femur condylar staind by Indian ink on week 1

组别     n                            分级Grade  

          Ⅰ级          Ⅱ级          Ⅲ级         Ⅳ级

阴性对照组   6           5              1             0          0 

低剂量组     6           2              4             0          0 

中剂量组     6           3              3             0          0 

高剂量组     6           3              3             0          0

阳性对照组   6           0              4             2          0

表2显示，手术后2周时，阴性对照组股骨内髁Ⅰ级5例、Ⅱ级1例，低剂量组股骨内髁Ⅰ级1例、Ⅱ级5例，中剂量组股骨内髁Ⅰ级1例、Ⅱ级4例、Ⅲ级1例，高剂量组股骨内髁Ⅰ级1例、Ⅱ级5例，阳性对照组股骨内髁Ⅱ级1例、Ⅲ级4例、Ⅳ级1例。经Kruskal-Wallis 秩和检验低、中、高剂量组与阳性对照组之间均有显著性差异（P<0.05），低、中、高剂量组之间无显著性差异（P>0.05）。

表2 手术后2周股骨内髁墨汁染色结果

Table 2 The results of femur condylar stained by Indian ink on week 2.

     组别   n                          分级Grade

        Ⅰ级           Ⅱ级          Ⅲ级         Ⅳ级

阴性对照组  6         5               1             0           0

低剂量组    6         1               5             0           0 

中剂量组    6         1               4             1           0

高剂量组    6         1               5             0           0 

阳性对照组  6         0               1             4           1 

表3显示，在手术后3周时，阴性对照组股骨内髁Ⅰ级5例、Ⅱ级1例，低剂量组股骨内髁Ⅱ级1例、Ⅲ级5例，中剂量组股骨内髁Ⅱ级4例、Ⅲ级2例，高剂量组股骨内髁Ⅱ级5例、Ⅲ级1例，阳性对照组股骨内髁Ⅲ级4例、Ⅳ级2例。经Kruskal-Wallis 秩和检验，低、中、高剂量组与阳性对照组之间均有显著性差异（P<0.05），中、高剂量组之间无显著性差异（P>0.05），低、高剂量组之间有显著性差异（P<0.05）。

表3 手术后3周股骨内髁墨汁染色结果

Table 3 The results of femur condylar staind by Indian ink on week 3.

  组别      n                         分级Grade

        Ⅰ级           Ⅱ级          Ⅲ级         Ⅳ级

阴性对照组  6         5               1             0           0 

低剂量组    6         0               1             5           0 

中剂量组    6         0               4             2           0 

高剂量组    6         0               5             1           0

阳性对照组  6         0               0             4           2 

2.2 关节软骨的光镜检查组织学变化

阴性正常对照组：HE染色示正常软骨基质呈淡粉色，着色均匀，软骨细胞核呈蓝色。软骨细胞排列有序，从上至下依次为表层、中间层、柱状层和软骨下骨层。潮线完整（图1A）。甲苯胺蓝染色均匀，无基质失染（图1B）。阳性对照组1周：HE染色细胞排列开始出现紊乱，有细胞簇聚现象（图1C）。甲苯胺蓝染色部分失染（图1D）。阳性对照组2周：HE染色软骨表层不平整，细胞排列进一步紊乱，细胞簇聚（图1E）。甲苯胺蓝染色软骨表层失染（图1F）。阳性对照组3周：HE染色软骨表层缺失，软骨层变薄，表面纤维化（图1G）。甲苯胺蓝染色软骨基质失染（图1H）。低、中、高剂量组1周：HE染色呈淡粉色，着色较均匀，排列基本正常（图1I）。甲苯胺蓝染色均匀，基本无失染（图1J）。低、中、高剂量组2周：HE染色表层完整，细胞排列柱状层略有紊乱，潮线完整（图1K）。甲苯胺蓝染色较均匀，表层略有失染（图1L）。中、高剂量组3周：HE染色表层基本完整，细胞排列出现紊乱，细胞出现簇聚现象（图1M）。甲苯胺蓝染色表层有部分失染（图1N）。低剂量组3周：HE染色表层略有起伏不平整，细胞排列紊乱，细胞簇聚现象较多（图1O）。甲苯胺蓝染色表层有失染（图1P）。

图1 兔关节软骨组织学HE和甲苯胺蓝染色结果代表性图片

Figure 1 The morphological change of cartilage investigated by HE and toluidine blue staining

注：A、B：阴性对照组；C、D：阳性对照组1周；E、F：阳性对照组2周；G、H阳性对照组3周；I、J：低、中、高剂量组1周；K、L：低、中、高剂量组2周；周M、N：中、高剂量组3； O、P：低剂量组3周。

A, B：negative control group；C, D：positive control group on week 1；E, F：positive control group on week 2；G, H：positive control group on week 3；I, J：low, moderate and high dose group on week 1；K, L：low, moderate and high dose group on week 2；M, N：moderate and high dose group on week 3；O, P：low dose group on week 3.

2.3关节液中IL-1β和TNF-α表达检测

    表4、表5显示，在术后1、2、3周，低、中、高剂量组关节液中炎性因子IL-1β和TNF-α均显著低于阳性对照组，但显著高于阴性对照组。

表4 各组关节液中IL-1β的含量（±s，pg/ml）

Table 4 The expression of IL-1β in synovial fluid of the knee joints.

分组         n         1周               2周                 3周          

阴性对照组   6      19.57±1.24     20.83±1.40       19.93±1.61 

低剂量组     6      37.49±1.81﹡＃  36.65±3.05﹡＃    44.12±4.04﹡＃

中剂量组     6      28.37±3.47﹡＃  31.74±2.38﹡＃    25.73±4.28﹡＃

高剂量组     6      27.48±2.44﹡＃  28.01±4.85﹡＃    26.14±5.49﹡＃

阳性对照组   6      57.51±3.03     79.55±1.41       66.71±2.37

注：﹡P<0.05，与阴性对照组比较；＃P<0.05，与阳性对照组比较。

表5 各组关节液中TNF-α的含量（±s，pg/ml）

Table 5 The expression of TNF-α in synovial fluid of the knee joints

分组          n        1周               2周                 3周          

阴性对照组    6      121.34±4.99      115.01±9.       120.19±7.61

低剂量组      6      537.14±18.48﹡＃  460.96±18.07﹡＃   6.83±14.55﹡＃

中剂量组      6      511.44±10.40﹡＃  405.27±4.43﹡＃    442.01±12.51﹡＃

高剂量组      6      498.69±9.10﹡＃   393.74±10.27﹡＃   457.06±13.15﹡＃

阳性对照组    6      726.83±20.11     563.36±21.40      749.97±15.54

注：﹡P<0.05，与阴性对照组比较；＃P<0.05，与阳性对照组比较。

3 讨论

氨基葡萄糖盐酸盐，白色结晶粉末，以甲壳素为原料，经酸充分水解制得，是一种小分子氨基多糖。经口服很容易通过小肠被动吸收，然后在肠粘膜细胞内去掉盐酸根，以氨基葡萄糖的形式进入血液。硫酸软骨素在自然界中，主要存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中，肌腱、韧带、皮肤、椎间盘等组织中也有；同时，也是哺乳动物血液、动脉血管组织内的主要成分。它是糖胺聚糖中的典型代表物质。氨基葡萄糖和硫酸软骨素是蛋白多糖合成的基本物质。氨基葡萄糖可以特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖,维护软骨基质的形态结构；还能抑制损伤软骨基质Ⅱ型胶原的超氧化自由基、胶原酶和磷脂酶A2的生成；抑制前列腺素的合成，保护皮质激素等各种有害物质对软骨细胞的破坏，从而延缓骨性关节退变的病理过程和疾病进展，改善关节活动，缓解疼痛[7-10]。氨基葡萄糖及硫酸软骨素的软骨保护作用还体现在能够提高滑膜产生透明质酸的能力，维持关节腔内正常透明质酸水平，口服补充可以促进关节软骨的代谢活动，使胶原、糖氨聚糖及其他结构蛋白的合成代谢增加，加强降低软骨面的退变，减轻骨性关节炎的症状。对关节软骨的保护和修复具有一定的积极作用。

在临床上亦有很多实验证实氨基葡萄糖和硫酸软骨素的安全性和有效性，Rovati[11]在一项随机双盲实验中，252例膝关节骨性关节炎的患者，分别服用氨基葡萄糖(每次500mg，每日3次)和对照服用安慰剂治疗4周时间，55%的患者膝关节疼痛、肿胀、活动受限症状明显减轻，而对照组仅为38%。Reichelt等[12]在一组病人中，肌肉注射硫酸氨基葡萄糖400mg，每周2次，治疗6周时给药组(55%)与安慰剂组(33%)在缓解症状上差异有显著性意义。Buesi[13]在观察硫酸软骨素治疗骨性关节炎的研究中发现：每次口服800mg，每日2次，连续服用6个月后，43%的患者症状明显改善，而服用安慰剂组仅有3 %改善，并能够显著延长患肢行走时间，症状的减轻也是持续的(分别在服用后1、3、6个月内达到15%、24%和37%)。联合服用这两种药物(氨基葡萄糖1500mg/d，硫酸软骨素1200mg/d)同样可达到明显的治疗效果。我们实验的给兔灌胃的中剂量组与此临床剂量相当。Clegg等将[14]1583例平均年龄为59岁的膝关节炎患者随机分为GS组(1500 mg/d)、CS组(1200 mg/d)、GS+CS组、吡罗昔康组(200 mg/d)和安慰剂对照组，疗程24周。结果显示，病情为中到重度患者GS+CS组的依从率显著高于安慰剂对照组。各组的不良反应都比较轻而少，且各组间差异无显著性。对中到重度疼痛患者，CS减轻关节肿胀较其减轻关节疼痛显著，而GS减轻关节疼痛几乎跟吡罗昔康类似，表明GS与CS组合对病情较重的患者更有效。

骨关节炎病人关节液中IL-1β的水平明显增高。有研究表明，氨基葡萄糖可以抑制IL-1β的活性，其作用机制有两个：①促进非活性的IL-1受体II(IL-1RII)的表达，让IL-1RII 与IL-1结合，使之不能触发信号传导产生炎性效应，从而竞争性地抑制IL-1β[15]；②抑制IL-1在软骨细胞内的信号途径，特别是抑制核因子-κB(NF-κB)活性[16]。除了抗炎作用以外，氨基葡萄糖还通过其他机制来缓解骨关节结构的破坏。骨关节炎的基质蛋白降解严重，这是由于金属蛋白酶激活，蛋白多糖降解增加所致。氨基葡萄糖可以调节胶原酶的活性[17]，还可以通过减少降解，促进合成而恢复葡萄糖胺聚糖的代谢失衡[18]。尽管作用机制尚不明确，但有研究表明，NF-κB的活性对MMP-1和MMP-3的增量调节是必须的[19]，氨基葡萄糖可能通过抑制NF-κB的激活而减少对关节软骨的损害[14]。硫酸软骨素也可能具有一定的抗炎特性，在抑制炎性因子的趋向性、吞噬细胞以及溶菌酶的活性等方面发挥作用。本研究结果显示，各治疗组在1、2、3周的关节液中炎性因子IL-1β和TNF-α均显著低于阳性对照组，但高于阴性对照组。这表明GS和CS能够减少骨关节炎的炎性反应，但不能恢复正常水平。

本研究结果表明，氨基葡萄糖和硫酸软骨素联合应用对不同时期的关节炎均有一定的保护和治疗作用。我们还发现在实验1、2周时，低、中、高剂量组之间无显著性差异，而在3周时中、高剂量组之间无显著性差异，低剂量组与高剂量组有显著性差异。表明到了骨性关节炎发展的中晚期，低剂量的效果低于中、高剂量组。这可能与低剂量不能满足机体需要有关。因此根据动物实验研究结果，我们推荐在临床上使用中剂量的GS和CS进行药物治疗。作为关节软骨基质中的重要成分，在体外及体内实验中均具有保护关节软骨的特性，临床应用中也能够减轻骨性关节炎的症状，给骨性关节炎的药物治疗提供了不同的方法，但长期疗效、停药后的效果以及剂量的安全性还需深入研究。

4 参考文献

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