国外对真菌毒素的研究进展

何  健，冯  民，朱臻怡，王小晋，李恒业，魏云计

（淮安出入境检验检疫局，江苏淮安 223001）

摘  要：本文调查了国外对真菌毒素的研究情况。通过查阅国外近年来发表的关于真菌毒素的文献，归纳总结了国外对真菌毒素的研究进展，对国外关于真菌毒素的危害研究、代谢动力学研究、真菌产生毒素的影响因素研究、检测方法研究、污染状况调查、预防措施和脱毒方法等方面进行了综述。

关键词：国外；真菌毒素；研究进展

The progress of mycotoxins researched abroad

He Jian , Feng Min, Zhu Zhenyi, Wang Xiaojin, Li Hengye, Wei Yunji

(Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huaian, Jiangsu, 223001, China)

Abstract: In this paper, The progress of mycotoxins researched abroad was investigated. Literatures about mycotoxins research abroad was consulted. In recent years, researchers was more concerned about the content of the following items: Mycotoxin contamination of the feed supply chain; Toxicokinetics of mycotoxin in animals; Influential factor of mycotoxin production;  qualitative and quantitative analysis of the mycotoxin; investigation of mycotoxin contamination in feed; Methods for preventing, decontaminating and minimizing the toxicity of mycotoxins in feeds.

Key words: abroad; mycotoxins; progress

真菌毒素（mycotoxin）一词源自希腊语的“mykes”，指真菌和“toxicum”，指毒物。真菌毒素（Mycotoxins）是由真菌自然产生的。人们目前所知道的真菌毒素就有上百种，但还有更多的真菌毒素不被我们所了解。真菌产生真菌毒素是自身的一种防御机制和/或有助于在宿主体内定植。真菌通过这一天然方法增强它们在环境中的竞争性。真菌毒素是有毒的二级代谢产物，农作物在大田生长、收获和贮存期间，由生长在作物上的真菌产生。真菌毒素通过饲料（浓缩料、青贮料或饲草）或铺草进入动物养殖生产系统。真菌毒素危害动物的生长、生产和繁殖性能，危害动物的健康和产品质量。由于真菌毒素种类繁多，真菌毒素以多种方式影响动物的健康和生产性能，诊断和确认真菌毒素中毒症通常是非常困难的。因此，探寻有效控制真菌毒素的措施对于生产效益、动物福利、产品质量和食品安全都是至关重要的。

国外对真菌毒素的研究主要包括真菌毒素的危害、毒物代谢动力学研究、真菌产生毒素的影响因素、检测方法研究、污染状况调查、预防措施、脱毒方法研究等。

1 对真菌毒素的危害研究

Wayne L等（2012）研究了饲料供应链中真菌毒素污染对动物产品和饲料安全的影响[1]，研究认为目前动物饲料受真菌毒素污染导致的主要问题不是急性疾病的发作，而是低含量毒素的长期摄入导致大量的代谢紊乱，影响动物生产率。在对猪和禽类的研究中发现，低含量毒素的长期摄入可以导致采食量的降低，生长率减缓，产蛋量减少，胴体品质变差，生育和孵化率降低，免疫力下降。真菌毒素的污染依然是饲料供应链各环节和动物养殖业发展过程中面临的巨大难题。

镰刀菌是研究最多的植物病原真菌，其易感染玉米、小麦、大麦和其他谷物食品和饲料，减少粮食产量和质量，造成全球性的重大经济损失。此外，镰刀菌会产生毒素，如蛇形菌素、脱氧瓜蒌镰菌醇、瓜萎镰菌醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、镰菌素、白僵菌素、念珠菌毒素和层出镰孢菌素。A.E. Glenn(2007)研究了动物饲料中几种镰刀菌及其危害[2]，文献介绍了饲粮中感染居主导地位的镰刀菌及其产生的毒素，讨论了其分类、亲缘关系和一般生物学研究。同时讨论了与生态和环境因素有关的并能导致饲料毒素污染的植物感染镰刀菌的两种疾病，头小杂粮玉米穗腐病和白叶枯病。镰刀菌的诸多细节，如形态学、生理学、遗传学和基因组学已被充分研究，这些数据对了解这些真菌，防止被其感染的食品和饲料安全至关重要。

2真菌毒素代谢动力学研究

Didier Tardieu(2008)研究了伏马毒素B1（FB1）的毒物动力学实验[3]。该研究通过静脉注射和口服的方式，用高效液相色谱法对火鸡组织样本进行检测，还实验了用欧盟允许FB1最大限量水平的禽类饲料喂养火鸡幼禽，考察FB1在组织内的残留情况。研究发现，静脉注射（单剂量：10mgFB1/kg体重），血清浓度-时间曲线通过一个三室开放模型来描述，FB1的消除半衰期和平均停留时间分别为85和52分钟。口服（单剂量：100mgFB1/kg体重）生物利用率3.2%，消除半衰期和平均停留时间分别为214和408分钟.FB1静脉注射和口服的清除率分别为7.6和7.5mL/min/kg.静脉注射24小时后，肝脏和肾脏中的FB1含量水平最高，肌肉中较低或未检测。还研究了9周喂养实验组织内残留情况（5、10、20mgFB1+FB2/kg）。还实验了摄入欧盟允许最大量（20mgFB1+FB2/kg）八小时后的组织残留情况，肝脏和肾脏中FB1浓度分别为119和22μg/kg，肌肉中则未检出。

Didier Tardieu(2009)还研究了伏马毒素B1（FB1）对鸭子的毒物动力学实验[4]，结果同样肝脏和肾脏有残留，但是肌肉中残留较低。

3真菌产生毒素的影响因素研究

Katrin Brzonkalik等（2011）考察了不同形态碳氮来源对链格孢霉属产生真菌毒素的影响[5]。研究的目的是考察不同形态碳氮来源对链格孢霉属毒素产物的影响，链格孢霉属在28°C使用半合成培养基培养，通过添加不同形态碳氮来源，调查其毒素产物产生量：格链孢醇(AOH)、交链孢醇单四醚(AME)、替奴佐酸(TA)。同时还研究了振摇培养和静止培养对毒素产生的影响，实验表明，真菌毒素的产生对应着培养基中氮的消耗，为了研究总氮或不同形态的氮对毒素产生的影响，实验中添加了不同的氮源，如铵盐/盐、氨基酸类。在静止状态下培养，苯丙氨酸的存在能极大的促进格链孢醇(AOH)、交链孢醇单四醚(AME)的产生。一些氮源则对AOH和AME存在抑制，不同氮源对替奴佐酸(TA)的产生无显著影响。在振摇状态下培养，所有真菌毒素的产生量低于静止状态培养。随后又实验了不同形态碳源比如单糖、二糖和复合糖类物如淀粉、甘油和乙酸盐等。在振摇状态下培养，添加的碳源包括：葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸盐和这几种的混合物的情况下产生了格链孢醇(AOH)，没有产生交链孢醇单四醚(AME)，在添加乙酸钠的情况下产生的格链孢醇(AOH)含量最高。在静止状态下培养，除了在乙酸钠存在下，AOH的产生量与振摇状态相当外，添加其余碳源，其AOH的产生量均偏低较多，14份样品在静止状态下培养下有9份产生了真菌毒素，而在振摇状态下只4份产生毒素。该文献首次研究了链格孢霉属的毒素产生受不同形态碳氮来源及培养状态的影响

Meri Kokkonen等（2005）研究了不同培养底物对几种青霉属菌株产生真菌毒素的影响[6]。使用的培养底物包括，酵母浸出液蔗糖(YES)琼脂培养基、奶酪、面包类似物，所产生的真菌毒素通过高效液相色谱仪（HPLC）PDA检测器测定。各培养底物接种后经培养均表现出不同的真菌毒素的产生能力，P.crustosum菌株在各类培养底物中均产生青霉震颤素，在奶酪中产生的毒素含量最高。青霉酸只在奶酪培养基中产生。P. verrucosum菌株在酵母浸出液蔗糖(YES)琼脂培养基中只产生橘霉素，在面包类似物培养基中能同时产生赭曲霉毒素A和橘霉素，各P. verrucosum菌株个体在面包类似物培养基毒素产生情况存在差异，在奶酪培养基几乎不产生真菌毒素。三种培养基对P.nordicum菌株的毒素产生影响较小，在培养过程中只产生少量的赭曲霉毒素A。

4 真菌毒素检测方法研究

橘霉素是由青霉属、曲霉菌属、红曲霉属的多种丝状真菌产生的一种毒素代谢产物，在自然界中广泛存在于谷物、食品、饲料原料以及生物制品中，该毒素对肝脏和肾脏的毒性能够导致动物体和人类的疾病暴发流行。Bao-jun Xu等（2006）对橘霉素的定性和定量分析方法进行了综述[7]，作者收集了1980年至2004年间国际上发表的有关橘霉素的文献，综述阐述了橘霉素的理化性质、定性定量方法，对不同检测技术的优缺点进行分析，通过对比不同分析方法中各吸附材质的层析性能、样品预处理能力、回收率和检测限等。总结并提出了关于检测橘霉素污染的国际性检测方法，并提出了一些具有建设性的产品质量控制方法的建议。

Mathias Devreese等（2012）建立了高效液相色谱串联质谱法定量检测猪血浆中多种真菌毒素的方法[8]。采用液相色谱串联三重四极杆质谱-电喷雾离子化法（LC–h-ESI-MS/MS）定性和定量测定猪血浆中的多种真菌毒素，如deoxynivalenol (DON), deepoxy-deoxynivalenol (DOM-1), T-2 toxin (T-2), HT-2 toxin (HT-2), zearalenone (ZON), zearalanone (ZAN), α-zearalenol (α-ZOL), β-zearalenol (β-ZOL), α-zearalanol (α-ZAL), β-zearalanol (β-ZAL), ochratoxin A (OTA), fumonisin B1 (FB1) and aflatoxin B1 (AFB1)。样品通过乙腈提取去蛋白，收集上层清夜，剩余物用水/甲醇（85/15, v/v）再提取，蒸发浓缩，每份血浆样品分析两次，即ESI+和ESI-两种模式分别测定。该法可以用于评估动物对真菌毒素的暴露情况和真菌毒素中毒的诊断。为了研究每种毒素的毒物动力学，又建立了特异性高灵敏度的单种毒素的LC–MS/MS方法。多残留检测方法和特异性检测方法经基体匹配校准曲线法验证，线性范围：0.9974-0.9999，变异系数：2.4~15.5%，方法的精密度和准确度良好，两种方法的定量限分别为：2-10 ng/mL及0.5-5 ng/mL，检出限分别为：0.01-0.52 ng/mL及0.01-0.15 ng/mL。

Rychlik and Asam(2008)发表了运用稳定同位素稀释法（SIDA）检测真菌毒素的综述报道[9]，文献指出目前使用13C和15N标记的真菌毒素多于使用2H和18O标记，原因在于，C和N是化合物分子骨架的组成元素，C-C键和C-N键不易断裂，而研究发现，在氘（2H）代的化合物中，H与D在所处溶液中会出现频繁的交换，并且还存在同位素效应，即同位素取代带来的物质物化性质的微小变化可能会引起保留时间（RT）的细微变化，这一点，氘代的物质相对C代或氮代的同位素物质比较明显。对于真菌毒素这类有机小分子物质，为了实现准确定量，同位素取代的分子量增加应在3以上，常见如：[13C17]-AFB1、[13C15]-DON、[13C24]-T-2等。

E. Varga等（2012）使用了稳定同位素稀释UHPLC-MS/MS法准确测定了玉米中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、呕吐毒素、HT-2毒素、T-2毒素等共11种真菌毒素[10]，通过添加11种同位素内标物，样品经乙腈/水/甲酸提取，直接进样，采用多反应离子监测（MRM）方式检测，方法回收率97%~111%，RSD4%~11%，测定质控样品，结果准确。

5 真菌毒素污染状况调查

Marijana Sokolović(2006)运用薄层色谱法对克罗地亚的谷物和动物饲料中的单端孢霉烯族毒素进行了调查[11]，收集了1998～2004年共计465个样本，大部分是家禽饲料，T-2毒素、蛇形菌素、脱氧瓜蒌镰菌醇的检出率分别为16.8%、27.6%、41.2%，毒素总量范围为：0.05～3.4mg/kg。

E.M. Binder(2007)介绍了对全球范围内商品饲料和饲料原料中真菌毒素的调查[12]。由饲料添加剂生产商（百奥明Biomin®）着手进行了一项2年之久的调查，目的是评估一些畜牧主产区的饲料和饲料原料中的真菌毒素导致的发病率。检测了镰刀菌毒素，包括脱氧瓜蒌镰菌醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、B2和B3，同时还检测了非镰刀菌毒素，包括赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1。分析了欧洲和地中海市场的1507个饲料样品的2753个项目，分析了亚洲和太平洋地区的1291个样品6391个项目，结果显示，超过50%的欧洲饲料样品污染物含量高于方法定量限，亚洲太平洋地区三分之一的样品检测为阳性。欧洲饲料样品中真菌毒素主要有脱氧瓜蒌镰菌醇、玉米赤霉烯酮和T-2毒素，而亚洲和太平洋地区则主要是脱氧瓜蒌镰菌醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素和黄曲霉毒素。

6 真菌毒素污染的预防措施和脱毒方法研究

饲料供应链中的农产品无论是在田间还是仓储环节，普遍含有真菌，一定条件下就产生了真菌毒素污染，Wayne L等（2012）认为应对这个复杂的问题的策略，是减缓真菌生长和减少毒素累积。有几种方案可以用来减少饲料中真菌毒素的产生，包括抑制真菌生长减少毒素产生，减少或消除已经受污染的饲料原料中的真菌毒素[1]。

植物在收获前就可能感染霉菌毒素，在收获后的储存和加工成食品和饲料的过程也可能感染霉菌毒素。Jean Pierre Jouany(2007)研究了预防，净化和尽量减少饲料真菌毒素毒性的方法[13]，作者认为可以将感染过程分为两类：（1）田间真菌（2）贮藏真菌。因此必须制定综合措施来预防真菌，减少霉菌毒素的污染，将措施分为三步，第一步，在感染真菌前的预防措施；第二步，真菌已经侵入植物或谷物并产生霉菌毒素；第三步，当农产品已被霉菌毒素严重污染时，采取的应对措施。应制定食品安全风险分析控制系统，找出确保食品安全的关键控制点，建立临界限值。控制的重点是前两个步骤，因为一旦毒素大量存在，现有的方法很难将其彻底脱除。

Alexander Huwig等（2001）认为铝矽酸盐是首选的吸附剂，其次是活性碳和聚合物[14]。J.B. Dixon(2008)介绍了利用蒙脱石对饲料中黄曲霉毒素的吸附研究，研究的目的是加快饲粮中黄曲霉毒素吸附剂的应用，减少动物受黄曲霉毒素毒害的风险[15]。研究涉及评估蒙脱石性能的几种方法，包括X射线衍射法对蒙脱石的鉴定；蒙脱石对黄曲霉毒素吸附的Langmuir等温线；傅立叶变换红外法测定结构组成；阳离子交换容量；激光衍射法测定粒度大小。文献提到粒度大小对吸附性的影响很大，有机物含量会影响蒙脱石对黄曲霉毒素的吸附。此外pH值和铝的影响知之甚少，需要进一步研究，

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