生物化学课件

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普通生物化学

第一章导论

重点:生物化学的概念、研究内容；生物化学与其他学科的关系。

第一节 生命、细胞和生物分子

一、生物分子

㈠生物分子是含碳化合物——碳能形成四个共价键

⒈与自身形成共价键

⒉与H、O、N形成共价键

⒊被键合碳原子周围四个共价键的四面体性质

——便于碳形成线性、有分支的或环状的化合物， H、O、N的参与更扩大其多样性。

㈡生物分子是分级的

⒈代谢物和大分子

⑴前体物：水、二氧化碳和三种无机氮化合物

⑵代谢物：简单有机物——细胞能量转化和合成大分子的构件时的中间物

⑶构件：小分子化合物

⑷大分子：构件分子通过共价键构成

⑸超分子复合物：一类或几类大分子中不同成员相互作用聚集形成具重要亚细胞功能的特殊装配体。

⒉细胞器

⒊膜

二、细胞是生命的基本单位

三、生物分子的特性

㈠方向性

㈡某些生物大分子是信息分子

㈢具特征性结构

㈣非共价作用力维持生物大分子的结构

㈤结构互补性影响生物分子的相互作用和生命状态

㈥生命活动在窄小环境范围内

第三节  生物化学与其他学科的关系

（一）生物化学的概念、研究内容

⒈概念：生物化学(Biochemistry)：研究生命现象化学基础的一门科学。

⒉研究内容： 

⑴静态生物化学：构成生物体的基本物质的结构、性质及结构与功能的关系。

⑵动态生物化学：生物体基本化学成分在生命活动过程中的化学变化规律。

⑶信息生物化学：核酸生物合成，蛋白质生物合成，物质代谢与基因表达的等。 

现代生物化学与分子生物学研究的重点和热点：

功能基因组学（functional genomics）；蛋白质组学（proteomics）；细胞信号转导（signal transduction）等。

（二）生物化学的研究发展简史

⒈准备和酝酿阶段（18c中期-20c初）：研究生物体的化学组成

⒉建立与发展阶段(20c初-20c中叶)：重要分子的发现和物质代谢途径的确定

⒊深入发展阶段(20c中叶-20c末)：分子生物学时期

⒋黄金时期（本世纪初—）：后基因组时期

我国科学家的贡献：1965年，结晶牛胰岛素：1981年，酵母丙氨酰tRNA：人类基因组计划（1%）等等。

（三）生物化学与其他学科的关系

⒈化学是学习生物化学的基础课程。随着生物学研究深入，物理学、数学及信息学也渗透到生物化学中。

⒉生物化学是生物学各学科的最基础的学科，生物化学的进步极大地推动了生物学各学科的发展。

分子生物学（Molecular Biology）：从分子水平认识和研究生命现象的科学，是生物化学学科的重要组成部分。

⒊生物化学是医学的一门重要基础课程，为其提供必要的理论基础

⒋生物化学是食品学的一门基础课程，为其提供必要的理论基础。

（四）学习内容

⒈静态生物化学：蛋白质、酶、维生素、核酸

⒉动态生物化学：糖类、脂类、蛋白质、核酸代谢

⒊信息生物化学：核酸生物合成，蛋白质生物合成，物质代谢与基因表达 

小结：生物化学的概念、研究内容；生物化学与其他学科的关系。

第二章、第三章蛋白质化学

重点：蛋白质组成、结构、性质及蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离、纯化和鉴定。

蛋白质重要性：是构成生物体的基本成分，生命活动的执行者,生命的物质基础。

蛋白质的生物学功能：生物催化；代谢调节；免疫保护；物质转运和贮存等。

蛋白质的分类：

按组成分类：单纯蛋白质和结合蛋白质

按肽链数目分类：单体蛋白质和寡聚或多体蛋白质

按功能分类:非活性蛋白和活性蛋白

按溶解度分类：可溶性蛋白质、醇溶性蛋白质和不溶性蛋白质

按分子形状分类：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。

(一)蛋白质的结构

一、蛋白质的元素组成：

C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、 S（0~4%）、P、I、Se等，特点：氮元素的含量平均约16%——凯氏（Kjadehl）定氮法

二、蛋白质的结构单位—— 氨基酸 (amino acid)

蛋白质氨基酸：编码氨基酸（标准或基本氨基酸：20种）和非编码氨基酸

1、氨基酸的结构通式：

结构特点：

（1）Cα结合（-NH3+）、（-COOH）、H原子和各种侧链（R）（Pro除外）；

（2）Cα是不对称C，具有手性（Gly除外），蛋白质氨基酸都是L-型。

2、氨基酸的分类：来源；营养学；侧链（R）。

根据R的化学结构：

（1）脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr；（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr；（3）杂环氨基酸：Trp、His；（4）杂环亚氨基酸：Pro。

根据R的极性：（1）非极性、疏水性氨基酸：R为烃基、苯甲基等；（2）极性、中性氨基酸：R为羟基、巯基、酰胺基等；（3）极性、酸性氨基酸；（4）极性、碱性氨基酸。

胱氨酸和二硫键

3.氨基酸的理化性质

(1).一般物理性质：无色或白色结晶，熔点>200℃，不同味道；均可溶于强酸、强碱和水，不溶于有机溶剂。

(2).两性电离性质：氨基酸分子带有能解离出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子。结合或释放质子取决于环境pH。

等电点（pI：Isoelectric point)：在一定pH环境下，氨基酸游离成阴、阳离子的程度及趋势相等或为兼性离子(Zwitterion)，氨基酸溶液的净电荷为零在电场中既不向阳极也不向阴极迁移时的pH值。

①    等电点的确定：酸碱滴定（滴定曲线）；

②    根据pK值（等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数）。

侧链不含离解基团的中性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’2 )/2   

侧链含有可解离基团的氨基酸：

酸性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 

碱性氨基酸：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2 

(3).紫外吸收性质：

20种氨基酸

可见光区：都没有光吸收

远紫外区(<220nm)：均有光吸收

近紫外区(220-300nm)： 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有光吸收

Trp、Tyr和Phe含共轭双键苯环，280nm处有最大吸收峰。分光光度法：测定蛋白质的含量，也可粗略估计核酸中蛋白质污染程度(A260/A280 <1.7)

(4).化学性质:α-NH2、α-COOH和R侧链的活性基团可发生相关化学反应。

1）α-NH2发生的化学反应

①与甲醛反应:α-NH2与甲醛反应生成二羟甲基氨基酸。甲醛滴定法

②与2,4-二硝基氟苯(DNFB或FDNB)反应：Sanger反应，α-NH2的H原子被烃基取代生成黄色DNP-氨基酸（二硝基苯基氨基酸）。烃基化反应，用于N端分析。

③与5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）反应：α-NH2的H原子被酰基取代生成5-二甲氨基萘磺酰氨基酸（DNS-氨基酸：荧光）。酰基化反应，取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，用于多肽分析。

④与异硫氰酸苯酯（PITC）反应：Edman降解,α-NH2的H原子被烃基取代生成苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），无水HF中生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸：无色）。氨基酸自动分析的基础。

⑤脱氨基反应：生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一。

2）α-COOH发生的化学反应

①成酯和成盐反应：羧基的化学性质被掩蔽，氨基的化学性质突出地显示出来。

②成酰氯反应：氨基酸的羧基活化，易与另一氨基酸的氨基结合。

③成酰胺反应：Asp（Glu）转化成Asn（Gln）。

④脱羧反应：生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一。

3）α-NH2和α-COOH共同参与的化学反应

①与茚三酮反应：氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中加热可产生有色化合物,含游离α-氨基的氨基酸和肽类生成蓝紫色化合物,脯氨酸(Pro)生成黄色化合物。

②成肽反应

4）R侧链的活性基团发生的化学反应

氨基酸以肽键共价连接形成线性序列——多肽链，多肽链折叠形成特殊的构象——成熟蛋白质。

蛋白质的结构层次：一级结构（primary structure ）；二级结构（secondary structure ）；三级结构（tertiary structure ）；四级结构（quaternary structure ）。

三、蛋白质的一级结构：蛋白质分子中氨基酸的线性序列。

⒈肽：

（1）概念：氨基酸通过肽键相连而形成的化合物。

肽键：一个氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键。

多肽链结构共性:

N-端：肽链有游离氨基一端

C-端：肽链有游离羧基一端

氨基酸残基(amino acid residues)：肽链中的每个氨基酸部分

多肽链主链（main chain of polypeptide chain ）：由肽键连接各氨基酸残基形成的长链骨架

多肽链结构差异性：

多肽链侧链(side chain)：多肽链中各氨基酸侧链基团

寡肽(oligopeptide)（20个以下氨基酸残基）

多肽 (polypeptide )（多于20个氨基酸残基）

蛋白质:由一条或几条多肽链组成的生物大分子。

（2）肽的书写格式及化学名称：

游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。

化学名称：某氨酰某氨酰 某氨酰……某氨酰某氨酸

（3）肽的理化性质：

酸碱性质

肽的酸碱性质决定于游离末端α-NH2、α-COOH及侧链R基上的可解离基团，肽键的酰氨氢不解离；可解离基团具特征性pKa值，末端α-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端 α-氨基的pKa值比游离氨基酸的小；环境pH值决定其电荷变化，pH>pKa：共轭碱形式（-COO -，NH2），pH旋光性

蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，具有旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。

化学反应

游离的α-氨基、 α-羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应。

（4）重要的多肽——生物活性肽

①谷胱甘肽 (glutathione,GSH)：谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸（三肽：结构）

②多肽类激素

③多肽类抗生素等等。

⒉一级结构(primary structure)：氨基酸的线性序列——蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。化学结构

一级结构中的共价键：肽键和二硫键（disulfide bond）。

一级结构是蛋白质的基本结构，决定蛋白质的空间结构。

⒊一级结构测定步骤

（1）纯化样品，N-端或C-端末端分析，测定由几条肽链组成。

N-末端氨基酸的分析：

Sanger法：Sanger反应生成二硝基苯衍生物,酸水解得到黄色DNP-氨基酸,可用乙醚抽提再进行色谱分析；

丹磺酰氯法：有很强荧光,灵敏度高；

Edman法：苯异硫腈(PITC)与氨基反应生成PTC-多肽,酸水解后得到PTH-氨基酸,用乙酸乙酯抽提后进行鉴定；

氨肽酶法：外肽酶——肽链外切酶

C-末端氨基酸的分析：

羧肽酶法：羧肽酶A水解脂肪或芳香族氨基酸的C-末端,羧肽酶B水解碱性氨基酸的C-末端；与苯甲醛沉淀等。

（2）拆分二硫键：

还原法：含巯基化合物（-SH）如2—巯基乙醇使-S—S-还原产生两个半胱氨酸残基（Cys-SH）,烷化剂（如碘乙酸）修饰-SH，阻止二硫键再生成；

氧化法：过甲酸使-S—S-氧化断裂，生成半胱氨磺酸。

（3）氨基酸组成分析：水解样品，氨基酸自动分析仪测定。

酸水解法：6mol/L HCl110℃加热回流16~24h, 完全水解，Trp被破坏，Gln,Asn酰胺基水解变成Glu,Asp(Glx,Asx)近年来用甲基磺酸代替盐酸。

碱水解法： 6mol/L NaOH 煮沸6h,完全水解，消旋，Ser、Thr、Arg、Lys和Cys破坏 。

（4）多肽链的部分断裂和肽段分离：将蛋白质分解为若干个一定长度的小片段。

酶水解法：内肽酶（肽链内切酶）

胰蛋白酶法：水解Lys或Arg的羧基形成的肽键

糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）法：水解Phe 、Trp 和Tyr 等疏水氨基酸的羧基形成的肽键

胃蛋白酶法：被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸如：--Phe---Phe--

化学法——CNBr法：裂解由Met羧基形成的肽键。

（5）测定每条小肽片段中的氨基酸排列顺序：Edman降解法

（6）推断蛋白质的氨基酸排列顺序：重叠肽拼凑

（7）确定二硫键和酰胺基的位置。

四、蛋白质的空间结构（构象：conformation）：高级结构，蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。构象决定着蛋白质的分子形状、理化性质和生物学活性。

1、蛋白质的二级结构(secondary structure):多肽链本身的折叠和盘绕方式，空间结构单元。

（1）、肽键平面：与肽键相关的6个原子（肽键-CO-NH-中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子）形成一个刚性平面。

N-Ca键（φ）和Ca-C键（ψ）：（－180°—＋180°）旋转。

二面角（φ，ψ）决定了相邻肽平面的相对空间位置。

蛋白质的构象取决于肽单位绕N-Ca键和Ca-N键的旋转，旋转受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的立体干扰的。

（2）、二级结构的型式

1）、α-螺旋 (α-helix)：肽平面通过α碳原子旋转，使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象。许多纤维蛋白和球蛋白存在。

结构要点：一般右手螺旋，φ＝－57°，ψ＝－47°。

每个螺旋圈：3.6个氨基酸残基，每个残基沿轴旋转100°，上升0.15nm，螺距0.54nm；

螺旋圈之间通过氢键维持结构稳定：第N个氨基酸残基的羰基氧与第N＋4个氨基酸残基的氨基氢形成氢键，氢键的走向平行于螺旋轴；

R侧链基团伸向螺旋的外侧，其大小、形状及电荷等是影响此结构形成的主要因素。

表示：3.613螺旋。（ns螺旋：310螺旋，4.416螺旋——π-螺旋）。

2）、β-折叠片层(β-pleated sheet)：肽链按层排列，以肽键平面为单位折叠成锯齿状的较伸展片层结构。许多纤维蛋白和球蛋白存在。

结构要点：每个残基大约占0.32～0.34nm，肽键平面遇Cα发生折叠,形成锯齿状结构，R侧链交错位于折叠片的上面和下面，两个残基形成一个重复单位；肽链按层排列，两条或多条肽链片段平行排列，形成片层结构，相邻多肽链的走向顺向或反向平行；相邻肽链上所有的羰基氧和氨基氢形成链间氢键维持结构的稳定性。平行(Parallel)：φ＝－119°，ψ＝＋113°；重复单位0.65nm。反平行(Anti-parallel)：φ＝－140°，ψ＝＋135°；重复单位0.70nm。

3）、β-转角(β-turn):多肽链反转方向180。的回折形成发夹形状。球蛋白存在。

结构要点：常位于三维结构的表面；一般四个氨基酸组成；氢键维持稳定：第1个氨基酸残基的C=O与第4个残基的N-H之间形成氢键。

4）、不规则卷曲(random coil)：没有确定规律性的松散肽链结构。

2、蛋白质的三级结构(tertiary structure)

（1）、超二级结构（super-secondary structure）：三级结构的“建筑模块”

1）、模体或模序（motif）：在空间上靠近的二级结构单元彼此相互作用，形成的有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。

常见类型：αα、βββ、βαβ等

2）、结构域（domain）：球状蛋白质的折叠单位。在模体或模序的基础上进一步绕曲折叠形成的具有部分生物功能的紧密的近似球形的空间结构区域。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。

（2）蛋白质的三级结构(tertiary structure)：多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。

结构特点：大多数可离子化的残基都位于分子表面，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部（特别是一些疏水性强的氨基酸），多肽链高度折叠成紧密球形或椭球形结构；稳定维系三级结构的作用力有：氢键、离子键、疏水键、二硫键和配位键。

三级结构对于蛋白质的分子形状和生物学活性非常重要。

肌红蛋白（Myoglobin ），丙糖磷酸异构酶等。

3、蛋白质的四级结构(quaternary structure)：两个以上多肽亚基（subunit）（非共价键连接）在蛋白质分子内的空间排布和相互关系。

亚基或亚单位（subunit）：每一条具有三级结构的多肽链。

血红蛋白（Hemoglobin） 

五、蛋白质分子中的共价键与次级键

1、共价键：肽键，二硫键

2、次级键：氢键，疏水键，盐键，范德华力

维持蛋白质空间结构的化学键：氢键，疏水键，盐键，范德华力，二硫键，配位键。

六、蛋白质的折叠（protein folding）：伸展的肽链形成特定的三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。

参与体内多肽链折叠的蛋白质

分子伴侣（molecular chaperone）：帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装的蛋白质。

酶：蛋白质二硫键异构酶，肽基脯氨酸顺-反异构酶等。

七、胶原蛋白（collagen）：原胶原蛋白分子头尾相连，交错排列，分子间共价交连，形成特征性的带状纤维束。

原胶原蛋白：3条左手螺旋多肽链相互缠绕形成右手超螺旋分子，长300nm，直径为1.5nm；靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持超螺旋结构稳定性。

胶原链：每一圈螺旋含3个氨基酸残基，每一个氨基酸残基轴向距离为0.31nm，螺距为0.94nm；三联体序列-Gly-Pro-Hyp-常重复出现。

（二）蛋白质结构与功能的关系

一、蛋白质一级结构与构象和功能的关系

1、一级结构不同,生物学功能各异：加压素和催产素

2、一级结构的关键部分相同，其功能也相同：同源蛋白

3、一级结构的关键部分变化,生物学活性改变或丧失

4、一级结构的变化与疾病的关系：镰刀状红细胞性贫血(Sickle cell anemia)

二、蛋白质构象与功能的关系

1、酶原的激活—空间构象的改变

2、蛋白质的变构现象—别构效应(allosterism)

别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。

别构效应(allosterism)：因别构而产生的效应称别构效应。

别构蛋白：具有别构效应的蛋白质。

血红蛋白的正协同效应（positive cooperativity）：第一个氧分子与一个亚基结合，使余下的3个亚基的血红素更容易与其它的氧分子结合。结合每一氧分子都会使血红蛋白对氧的亲和性增加，这种互相作用的结合现象称之结合的正协同性。

波尔效应（Bohr effect）：CO2浓度的增加降低细胞内的pH，血红蛋白结合H＋和CO2使得血红蛋白对氧亲和力下降，血红蛋白的P50升高。

（三）蛋白质的理化性质及其分离纯化

一、蛋白质的理化性质

1、蛋白质两性解离特性：蛋白质具有可解离H+的酸性基团和结合H+的碱性基团，具有两性解离特性，在溶液中起酸碱缓冲作用。

（1）等电点（pI）: 使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液pH值称为该蛋白质的等电点。

pH＜pI,蛋白质带正电；pH>pI,蛋白质带负电,体内蛋白质的pI多5左右,生理条件下一般负离子；等电点pH时为两性离子。

（2）各蛋白质的一级结构不同，pI不同，荷电种类和数量也不同。

（3）应用：等电点沉淀、离子交换层析和电泳。

电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）：是依据流动相中的组分离子与离子交换剂（固定相）上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

阴离子交换层析基本分离过程：

①阴离子交换剂装柱平衡（R——X+Y-）

②加样（待分离溶液：可能有正电基团、负电基团和中性基团）：负电基团（A-）与平衡离子（Y-）进行可逆置换，结合到离子交换剂上（R——X+A-）。正电基团和中性基团不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。

③洗脱；洗脱液中的离子与结合在离子交换剂上的各种负电基团（A-）进行置换，各种负电基团（A-）按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，随洗脱液流出。

2、蛋白质的亲水特性

（1）、球状的水溶性蛋白亲水基团分布于分子表面，疏水基团由疏水作用聚合在分子内部。

（2）、分子表面的亲水基团与周围水分子结合形成水化层(水膜)。

（3）、分子表面的亲水基团可结合或释放H+,带一定电荷，水溶液中蛋白质颗粒带相同电荷。

3、蛋白质的胶体性质：蛋白质水溶液是稳定的胶体溶液，具有胶体溶液的特点。

蛋白质胶体溶液稳定的原因：

1）胶体颗粒直径；2）表面形成水膜（水化层）；3）带相同电荷。

4、蛋白质的沉淀反应：破坏胶体溶液稳定的因素。

（1）、中性盐沉淀反应：高盐破坏水膜、中和电荷,蛋白质聚集沉淀—盐析，蛋白质不变性。

盐溶作用：稀盐使蛋白质表面同性电荷增加，增加蛋白质分子间的排斥,同时与水分子间的作用增强,而增加溶解性。

分级（段）盐析：不同蛋白质盐析的盐浓度不同,用不同盐浓度分级沉淀蛋白质。

（2）、有机溶剂沉淀反应：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取水膜,等电点时加入更易沉淀,易引起变性（与有机溶剂浓度、作用时间和沉淀温度有关）。

（3）、重金属盐沉淀反应：蛋白质在体内一般为负离子,可与Cu2+，Hg2+，Ag+和Pb2+等结合为不溶性蛋白盐而沉淀。

（4）、生物碱试剂的沉淀反应：蛋白质在pH（5）、加热沉淀反应 ：蛋白质热变性沉淀，等电点时最易沉淀。

凝固：变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象。

5、蛋白质的变性与复性

（1）、蛋白质变性:

概念：在理化因素作用下,蛋白质分子内的二硫键和非共价键被破坏,分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，天然构象发生变化,引起蛋白质理化性质和活性的改变（原有性质发生部分或全部丧失）。

变性本质:空间构象的改变或破坏。

变性特征:

1）生物活性丧失（主要标志）。

2）理化性质改变：

①分子形状改变，肽链松散伸展，反应基团增加，易被水解,易被酶消化。

②蛋白质变性后亲水基团被掩埋,溶解度降低、失去水膜，易形成沉淀析出;但若溶液pH与蛋白质的pI差别较大,蛋白质仍不易沉淀。

③球状蛋白质的不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低,某些蛋白质结晶能力丧失。

（2）、蛋白质复性：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。

6、蛋白质的其它特性

（1）、紫外吸收特性：Trp、Tyr、Phe等氨基酸残基可特异地吸收紫外光:λmax=280nm

（2）、颜色反应

双缩脲反应：肽键与碱性铜溶液产生兰色络合物，肽键越多颜色越深。用于蛋白质定性定量和检测蛋白质水解程度。

酚试剂反应：碱性条件下,Tyr和Trp可与含磷钨酸-磷钼酸的酚试剂化合物生成兰色物,兰色强度与蛋白质量成正比,测定蛋白质常用方法。

米伦反应、黄色反应、乙醛酸反应(Hopking-Cole反应、坂口反应(Sakaguchi反应)、茚三酮反应等。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质研究基本步骤：一般温和物理方法（盐析、透析、电泳、层析和超速离心等）提取和纯化蛋白质；测定氨基酸组成，分析氨基酸顺序；确定空间结构（X射线衍射法、NMR或生物学软件推测）并进行生物学活性的鉴定。

1、生物大分子的制备

（1）、生物大分子制备的特点(与化学产品的分离制备比较)

1）许多生物大分子含量微，耗用生物材料多；2）分离纯化的步骤多，流程长；

3）分离纯化方法差别大，没有标准方法；4）生物大分子极易失活，分离纯化时要选用最适宜的环境和条件防止失活；5）制备中各种参数的综合影响，很难准确估计和判断，实验的重复性较差；6）制备过程复杂困难，更需百折不挠的钻研精神。

（2）、生物大分子制备的基本步骤

1）确定制备目的和要求；2）掌握目的产物的物理化学性质；3）建立相应的可靠的分析测定方法；4）生物材料的破碎和预处理；5）选择和探索分离纯化方案；

6）纯度鉴定；7）产物的浓缩，干燥和保存。

2、蛋白质的制备

（1）、前处理：

1）选择适当的生物材料（适合制备的目的和要求；尽可能保持新鲜）。

2）加工处理：动物组织除结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎；植物去壳、除脂；微生物材料及时将菌体与发酵液分开

3）破碎细胞

①机械法：研磨；组织捣碎器②物理法：反复冻融法；超声波；压榨法；冷热交替法③化学与生物化学方法：自溶法；溶胀法；酶解法；有机溶剂处理法。

4）提取蛋白质：目的蛋白保持天然状态充分释放到溶剂中。

①水溶液：稀盐溶液和缓冲液。

通常0℃～5℃使用0.02mol/L～0.05mol/L缓冲液或0.09mol/L～0.15mol/LNaCl溶液pH=6～8(偏离等电点的两侧)提取蛋白质和酶。加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性使蛋白酶或核酸酶失活；加入少量巯基乙醇或半胱氨酸防止巯基氧化。

②有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等

（2）、分离纯化：

依据目的蛋白与杂质之间的物理化学和生物学性质上的差异，选择正确的分离纯化方法（分离纯化方案）

1）分离纯化方法

①以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。

②以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。

③以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。

④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等 

2）早期和晚期的分离纯化方法

①早期分离纯化（粗分级）：除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。

方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换；亲和层析等——快速、粗放；能较大地缩小体积；分辨力不太高；负荷能力大。

②晚期分离纯化（细分级）：除去与目的产物物理化学性质差异小的杂质。

方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。

3）蛋白质含量测定与纯度鉴定：

①含量测定：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法，标准测定方法）、紫外吸收法、染料（考马斯亮蓝）结合法、胶体金法。

②均一性的鉴定：电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等（同时采用2～3种不同的纯度鉴定法确定）。

（3）、样品浓缩、干燥和保存：

浓缩：减压加温蒸发浓缩；空气流动蒸发浓缩；冷冻干燥法；吸收法；超滤法；透析法等。

干燥：冷冻或真空干燥，然后分装并写明标签。

保存：－20℃—－70℃保存（液态样品不能太稀，一般需加入防腐剂和稳定剂。）

小结：蛋白质组成、结构、性质及蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离、纯化和鉴定。