高温胁迫对高羊茅细胞膜及其核DNA伤害的初步研究

李良霞，李建龙*，张强

南京大学生命科学院，南京 (210093）

E-mail：jlli2008@nju.edu.cn

摘要：通过盆栽试验研究了高温逆境（35/30°C，白/昼，20d）对两种耐热性不同的高羊茅（热耐受型美洲虎3号和热敏感型TF66）叶片和根系内的膜脂过氧化程度、细胞膜完整性以及核DNA的影响。结果表明，高温胁迫下：（1）美洲虎3号和TF66的叶片和根系丙二醛（MDA）含量都增加，但两高羊茅品种根系内MDA含量均比叶片内低；（2）两高羊茅品种的叶片和根系内细胞电解质外渗率（EL）均明显增加；（3）同等胁迫水平下，热敏感型TF66的MDA含量和EL水平均高于热耐受型美洲虎3号；（4）两高羊茅品种叶片和根系基因组DNA均没有受到伤害。综合评定的结果，可知较低的MDA含量和EL水平可能是冷季型草坪草抗高温的标志之一,而DNA受伤害状况可能并不适合作为筛选高羊茅耐热性大小的重要指标。

关键词：高温胁迫；高羊茅；膜脂过氧化；细胞膜透性；核DNA

中图分类号：S566.109 文献标识码：A

植物细胞膜是植物细胞的基本结构，包括内膜和质膜系统，其中植物叶片内膜系统包括叶绿体，线粒体和高尔基体等。质膜不仅为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，同时还起着物质的跨膜运输，信号转换以及细胞识别等作用。植物细胞膜是感知高温逆境对其造成伤害最敏感的部位之一[1]，细胞膜系统对高温逆境的适应能力高低也是体现细胞膜系统抗逆性强弱的标志之一[2]。目前，膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）和细胞电解质外渗率（EL）通常被作为描述细胞膜热稳定性状况的有效指标，同时也是表示热胁迫对植物造成直接伤害程度大小的有效指标。

DNA作为重要的遗传物质，在逆境胁迫条件下的作用与代谢引起了越来越多人的关注。大量的实验证明，高温胁迫可以造成植物体内活性氧的积累，大量积累的活性氧会引发植物膜脂氧化，对植物产生“氧化性”胁迫[3，4]，并有可能造成一定程度上DNA双链裂解[5,6,7]。Siobhan等人指出，胁迫条件下植物基因组DNA的变化状况和基因表达状况可以作为植物对外界的胁迫的响应状况的其中指标之一[8]。一般情况下，受到伤害的DNA可以通过自我修复机制快速修复。但持续的快速修复却容易引起转录错误、基因突变甚至细胞死亡。如果胁迫程度过高，DNA的修复也不可进行，最终也会引起植物死亡。目前对于植物高温胁迫方面的报道已有很多，但有关高温胁迫对冷季型草坪草细胞膜及其DNA伤害的报道尚未见到。为此我们选用两种耐热性不同的高羊茅作为材料，研究高温胁迫下它们叶片和根系膜脂过氧化程度、细胞膜透性（细胞电解质外渗率）以及DNA受伤害情况，诣在揭示高羊茅草种耐热性的生理生化机制并筛选鉴定高羊茅耐热性的重要指标，为我国南方广大地区引进和推广该草种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1实验材料

供试材料是冷季型草坪草品种美洲虎 3 号和 TF 66，草种由克劳沃草业集团提供。

1本课题得到江苏省农业三项工程项目（SX（2005）098的资助。

1.2试验处理

选择健康的美洲虎3号和TF 66草种播种在装有混合培养基质（沙子：蛭石：有机营养土=3：1：1）的聚乙烯花盆中。花盆直径为20cm，深6cm,每个品种重复栽培12盆。高温胁迫前，放在全自动光照培养箱中，保持20/15℃（白/昼）的恒温，每天以400 µmol m-2 s-1的强度光照14h，培养70d（包括萌发时间8d）。70d后将植株平均分为两部分：一部分维持原来的培养条件，作为对照组；另一部分转移到到高温 35/30℃（昼/夜）的光照培养箱中，培养20d。其他供试样品维持原来培养条件，作为对照组。在正常培养和高温胁迫过程中，每周给供试品种修剪至8cm高度，每日浇水，每周施以Hoagland全元素营养液[9]。试验的相应指标分别在高温胁0d、10d、20d测定。

1.3测定指标

叶片和根系膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量的测定根据硫代巴比妥酸（TBA）显色法略加修改[4]；叶片和根系电解质外渗率（EL）的测定参照王钦和Jeffrey等人的方法[10]，略加改进。基因组DNA的提取及其电泳测定参照Meriga[6]等人的方法，略有改动；基因组DNA荧光分子探针检测参照Batel等人的快速微量测定方法，测定DNA单链碱性不稳定位点[11]。

1.4 统计分析

使用SPSS软件进行数据的统计分析，利用Duncan多样性比较检验进行方差分析（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对高羊茅草坪草根系和叶片内MDA含量的影响

MDA是衡量膜脂过氧化程度的主要指标，植物遭受高温胁迫时，自由基积累，膜脂过氧化水平增高，MDA含量增加。高温胁迫下，两高羊茅品种叶片和根系内的MDA含量均明显增加（图1图2），胁迫10d时, “美洲虎”3号叶片和根系的MDA含量分别比对照增加19.12%和4.12%，TF66分别比对照增加26.28%和38.27%；胁迫20d时，“美洲虎”3号叶片和根系的MDA含量分别比对照增加52.21%和67.01%,而TF66分别比对照增加105.12%和111.11%。可见高温胁迫下两品种的MDA含量增幅都是根系大于叶片。常温下，两品种叶片和根系的MDA 含量没有明显差别（P>0.05），但在胁迫条件下，TF66叶片和根系的MDA含量比美洲虎3号更高,增幅更大（P<0.05）。

图1 高温胁迫10d和20d后草坪草叶片中MDA含量

Fig.1 levels of MDA in turf leaves after 10d and 20d heat stress

图2 高温胁迫10d和20d后草坪草根系中MDA含量

Fig.2 levels of MDA in turf roots after 10d and 20d heat stress

2.2 高温胁迫对高羊茅草坪草叶片和根系内EL水平的影响

细胞电解质外渗率（EL）长久以来被认为是能很好地表示热胁迫下自由基对细胞膜伤害程度及其膜热稳定性大小的指标。常温下，两高羊茅品种的叶片和根系EL没有明显差别，高温胁迫下，美洲虎3号和TF66的叶片、根系细胞电解质外渗率（EL）均显著增加，且同等胁迫水平下TF66的叶片和根系的EL水平均显著高于美洲虎3号（P<0.05）。

胁迫10d时，“美洲虎”3号叶片和根系电解质外渗率分别比对照增高44.44% 和53.18%，TF66分别比对照增高67.22% 和 71.63%；胁迫20d时，“美洲虎”3号叶片和根系电解质外渗率比对照增高112.30% 和149.12%，而TF 66比对照增高172.22%和170.26%。

图3 高温胁迫10d和20d后草坪草叶片电解质外渗率

Fig.3 levels of EL in turf leaves after 10d and 20d heat stress

图4 高温胁迫10d和20后草坪草根系电解质外渗率

Fig. 4 levels of EL in turf roots after 10d and 20d heat stress

2.3 高温胁迫对高羊茅草坪草叶片和根系基因组DNA的影响

DNA琼脂糖凝胶电泳是检测DNA受伤害的常用方法，前人的研究发现细胞膜脂过氧化程度越高，核DNA受伤害的可能性越大。图5的电泳图谱显示，即使在热敏感的TF66中，处理20d后其根系MDA水平比对照高111.11%时仍然没有出现DNA伤害。从而表明，无论是10d 还是20d的高温胁迫对两种草坪草的叶片和根系的DNA均没有造成伤害。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

图 5 高温胁迫10d和20d后草坪草DNA电泳图谱

Fig.5 Electrophoresis of DNA of Turf grass after 10d and 20d heat stress

注释：

M：marker

1：高温胁迫前美洲虎叶片2：高温胁迫10天美洲虎叶片3：高温胁迫20天美洲虎叶片

4：高温胁迫前TF 66叶片5：高温胁迫10天TF 66叶片6：高温胁迫20天TF 66叶片

7：高温胁迫前美洲虎根系8：高温胁迫10天美洲虎根系9：高温胁迫20天美洲虎根系

10：高温胁迫前TF 66根系11：高温胁迫10天TF 66根系 12：高温胁迫20天TF 66根系

1: electrophoresis of DNA in leaves of Jaguar 3 brand before heat stress

2: electrophoresis of DNA in leaves of Jaguar 3 brand after 10d heat stress

3: electrophoresis of DNA in leaves of Jaguar 3 brand after 20d heat stress

4: electrophoresis of DNA in leaves of TF 66 before heat stress

5: electrophoresis of DNA in leaves of TF 66 after 10d heat stress

6: electrophoresis of DNA in leaves of TF 66 after 20d heat stress

7: electrophoresis of DNA in roots of Jaguar 3 brand before heat stress

8: electrophoresis of DNA in roots of Jaguar 3 brand after 10d heat stress

9: electrophoresis of DNA in roots of Jaguar 3 brand after 20d heat stress

10: electrophoresis of DNA in roots of TF 66 before heat stress

11: electrophoresis of DNA in roots of TF 66 after 10d heat stress

12: electrophoresis of DNA in roots of TF 66 after 20d heat stress

2.4 高温胁迫对高羊茅叶片和根系DNA双链裂解指数（SSF）的影响

双链断裂是DNA损伤的主要类型之一[12]，人们通过检查DNA双链分子的断裂情况来研

究高温对DNA的影响[13]。由表6可知，经过10d和20d的高温胁迫后，两高羊茅草坪草叶片和

根系的SSF非常接近于0，达到了极显著水平，两高羊茅品种之间以及高温处理前后均没有

差异（P>0.05），表明高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片和根系的核DNA均没有造成伤害。

表6 DNA双链裂解指数（SSF）

Table 6 DNA strand scission factor (-1)

叶片根系

66

66 Jaguar TF

Jaguar TF

处理10天0.0025a 0.0027a 0.0020a 0.0036a 处理20天0.0028a 0.0024a 0.0028a 0.0037a3 讨论

高温胁迫下，两种耐热型不同的高羊茅草坪草叶片和根系的MDA含量和细胞膜透性（EL）均持续增加，表明两种高羊茅的膜脂过氧化发生，细胞膜遭到了一定的破坏，而且这种破坏随着胁迫时间的延长而加剧；无论是胁迫10d还是20d时，TF 66叶片和根系内MDA 含量和膜透性都比“美洲虎”3号的高，说明“美洲虎”3号比TF66更能减少膜脂过氧化，这种差别可能与高温胁迫下“美洲虎”3号较TF66有更高的光合速率有关；高温胁迫下，耐热型“美洲虎”3号和热敏感型TF66根系内MDA含量均比叶片内低。这可能由于高温胁迫引起的“氧化性”伤害同时发生在叶绿体和线粒体里，而在根系里只发生在线粒体内。

已有的研究表明，逆境可以使生物体内活性氧增加，造成植物膜脂氧化，最终有可能导致生物体原有DNA双链结构被破坏[14,15]。Meriga等人研究后发现，铝敏感的水稻在由铝而引起的膜脂过氧化程度比对照高大约15%时出现了DNA伤害状况，而对铝不敏感的水稻在膜脂过氧化程度比对照高大约90%时才出现了DNA伤害状况。我们的研究表明，高温胁迫下两种高羊茅叶片和根系基因组DNA均没有受到伤害。

双链断裂是DNA损伤的主要类型之一[16,17] ，为进一步验证高温胁迫对两种高羊茅草坪草核DNA的伤害结果，我们又进行了核DNA荧光分子探针检测[18,19] ，即通过检查DNA双链分子的断裂情况，来研究高温胁迫对DNA的影响[20，21]。检测和计算结果显示高温胁迫对两种高羊茅草坪草叶片和根系的核DNA没有造成伤害。这与核DNA琼脂糖凝胶电泳结果一致。说明在我们所选的温度处理（35/30°C，白/昼，20d）下，高羊茅本身可能还能进行有效的修复。同时DNA伤害状况可能并不太适合作为选择高羊茅草坪草耐热性大小的重要参考指标。这个问题还有待更进一步的研究。

总之，高温胁迫下两种高羊茅草坪草叶片和根系膜脂过氧化程度和细胞膜透性急剧增加，细胞膜系统受到了一定程度的伤害。但无论是10d还是20d的高温胁迫（35/30°C，白/昼）对两种耐热性不同的高羊茅叶片和根系的核DNA均没有造成伤害。

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The effects of high temperature on cell membrane and nuclear DNA damage of tall fescue turfgrass

Li Liangxia，Li Jianlong*，Zhang Qiang

College of Life Science，Nanjing University，Nanjing (210093)

Abstract

In order to understand the effects of high temperature（35/30°C，day/night，twenty days） on lipid peroxidation, cell membrane thermostability and nuclear DNA of two tall fescue cultivars, Jaguar 3 brand(heat-tolerant) and TF 66(heat-sensitive), a pot experiment was carried out. The results showed that: (1) High temperature stress markedly increased MDA content in leaves and roots of the both cultivars, however, it increased more significantly in leaves than in roots of both cultivars; (2) Levels of EL in leaves and roots of both cultivars increased after high temperature stress; (3) Under the same stress condition, TF 66 retained significantly higher MDA contents and EL levels than Jaguar 3 brand;

(4) Very little nuclear DNA damage was found in the two stressed cultivars. It suggests that lower MDA content and EL level may be important indicators associated with tolerance of heat stress in tall fescue turfgrass, while the damage degree of nuclear DNA may be not appropriate index to select heat-tolerant tall fescue turfgrass. .

Keywords：High temperature stress，Tall fescue turfgrass，Lipid peroxidation，Cell membrane thermostability，Nuclear DNA

作者简介：

李良霞（1982-），女，汉，安徽，硕士研究生，主要研究方向为草坪草抗性生理生态学；

李建龙，男，汉，教授，主要从事草地生态学与城市生态学研究。

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