HBsAg单克隆抗体的制备

HBsAg主要有adr、adw、ayw、ayr等血清学亚型，欧美国家人群感染的HBV以adw亚型为主，而在我国主要是adr亚型［7⁃11］。我国现有重组酵母乙型肝炎疫苗所用HBsAg主要为adw亚型，而符合中国流

adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备

马锐1，张国强1，李津1，张德有1，王曦1，张小刚2，王远征1，魏静1，赵铠1，3

1.北京天坛生物制品股份有限公司，北京100024；

2.京天成（北京）生物技术有限公司，北京101111；

3.北京生物制品研究所有限责任公司，北京100024

摘要：目的制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）单克隆抗体，并用其区分两亚型HBsAg。方法利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体，采用间接ELISA法进行筛选；优化鉴别试验抗原包被剂量，并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证。结果共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体

7株；鉴别试验抗原的最佳包被剂量为10μg；1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adw A450/adr A450

值均大于2，判定其为adw亚型；1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adr A450/adw A450值均大于2，判定其

为adr亚型；3A5株单抗检测4份编盲样品的adr A450/adw A450值和adw A450/adr A450值均小于2，未能区分两亚型HBsAg。

结论抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。

关键词：乙型肝炎表面抗原；adr亚型；adw亚型；单克隆抗体

中图分类号：R373.2+1R392⁃33文献标识码：A文章编号：1004⁃5503（2014）04⁃0544⁃04 Preparation and of monoclonal antibody against hepatitis B surface

antigen of subtypes adr and adw

MA Rui*，ZHANG Guo⁃qiang，LI Jin，ZHANG De⁃you，WANG Xi，ZHANG Xiao⁃gang，WANG Yuan⁃zheng，

WEI Jing，ZHAO Kai

*Beijing Tiantan Biological Products Co.，Ltd，Beijing100024，China

Corresponding author：MA Rui，E鄄mail：gsm186@126.com

Abstract：Objective To prepare the monoclonal antibodies（McAb）against hepatitis B surface antigen（HBsAg）of subtypes adr and adw，and use for differentiation of the two subtypes.Methods The McAbs against HBsAg of subtypes adr and adw were prepared by hybridoma cell fusion technique，and screened by indirect ELISA.The dosage for coating of antigen for identity test was optimized，and the identity test for HBsAg subtype was verified.Results Seven hybridoma cell strain secreting McAbs against HBsAg of subtypes adr and adw were obtained.The optimal dosage for coating of antigen for identity test was10μg.The adw A450/adr A450values of two blinded HBsAg subtype adw samples determined with McAbs secreted

by strains1H6and4D3were more than2，indicating the McAbs as subtype adw.The adr A450/adw A450values of two blinded HBsAg subtype adr samples determined with McAb secreted by strain1E9was more than2，indicating the McAb

as subtype adr.However，the adr A450/adw A450and adw A450/adr A450values of four blinded HBsAg samples determined with McAb secreted by strain3A5were less than2，indicating that McAb failed to identify the HBsAg of two subtypes.

Conclusion The McAb against HBsAg of subtype adr secreted by strain1E9，and those against subtype adw secreted by strains1H6and4D3may be used for the identification of HBsAg subtype during development of Hansenula anomala⁃derived hepatitis B vaccine of subtype adr.

Key words：Hepatitis B surface antigen（HBsAg）；adr subtype；adw subtype；Monoclonal antibody（McAb）

基金项目：国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防

治”（2012ZX10002002⁃002）.

通讯作者：马锐，E⁃mail：gsm186@126.com

·诊断制剂·行规律的adr亚型疫苗却相对较少。为此，北京天坛生物制品股份有限公司制备了符合中国流行规律的

adr亚型HBsAg（adr⁃HBsAg）重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母），而建立有效方法鉴别两种亚型HBsAg是adr 亚型重组乙型肝炎疫苗研究的基础。本实验以adw 和adr亚型HBsAg免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞融合技术制备可区分HBsAg两种亚型的单克隆抗体，为建立疫苗亚型检测方法奠定基础。

1材料与方法

1.1抗原及细胞adw亚型HBsAg（adw⁃HBsAg）由北京天坛生物制品股份有限公司乙型肝炎疫苗室提供；adr⁃HBsAg由北京天坛生物制品股份有限公司疫苗研究二室制备，为rHadrHBV404株重组汉逊酵母工程菌经发酵扩菌、诱导抗原表达并提取纯化获得；SP2/0细胞购自Cascade Biologics，Inc.公司。

1.2主要试剂弗氏完全佐剂（CFA）、弗氏不完全佐剂（IFA）和PEG4000均购自美国Sigma公司；DMEM 培养基和胎牛血清（FBS）购自美国HyClone公司；HRP 偶联的羊抗鼠IgG Fc购自美国Jackson Immun公司；Protein G亲和柱购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3实验动物SPF级BALB/c小鼠，雌性，8~10周龄，体重28g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：11400700040880，屏障条件下饲养。

1.4单抗的制备将adr⁃HBsAg和adw⁃HBsAg （0.3mg/只）分别与等量的CFA或IFA混合，第0天用与CFA混合的免疫原免疫3只小鼠，14d后用与IFA混合的免疫原加强免疫。加强免疫7d后，经小鼠尾静脉采血，检测其针对adr亚型及adw亚型HBsAg的反应性。取反应滴度最高的小鼠脾脏，分离单个核细胞（mononuclear cell，MNC），经PEG4000与SP2/0细胞按4∶1比例融合，用含20%FBS和2% HAT的DMEM培养3d后，接种至含20%FBS和2% HAT的DMEM培养基的96孔板中培养14d。采用间接ELISA法筛选阳性克隆，每株阳性克隆细胞接种2只小鼠，10~14d后收集腹水，用Protein G亲和柱纯化腹水，获得纯化的抗体。

1.5单抗的筛选采用间接ELISA法。分别用100μl adr⁃HBsAg和adw⁃HBsAg包被96孔板，阴性对照孔加入含100ng/ml脱脂奶粉的PBS溶液100μl，4℃过夜；PBS洗板3次，加入200μl含5%脱脂奶粉的PBS溶液，室温封闭1h；PBS洗板3次，加入纯化的单抗0.1μg，室温孵育1h；PBS洗板3次，加入HRP

偶联的羊抗鼠IgG Fc（1∶2000稀释），孵育1h；PBS 洗板5次，加入100μl TMB底物，室温反应15min；加入1mol/L硫酸终止反应，经酶标仪测定A450值，并计算adr亚型与adw亚型A450值的比值及adw亚型与adr亚型A450值的比值，以adr A450/adw A450>2判为adr亚型，adw A450/adr A450>2判为adw亚型。

1.6鉴别试验抗原最佳包被剂量的选择及单抗的鉴定取adr⁃HBsAg和adw⁃HBsAg，分别按1、10、100μg/孔3个剂量包被96孔板，每孔100μl，每个剂量设3个复孔，阴性对照孔加入含100ng/ml脱脂奶粉的PBS溶液100μl，选取adr和adw亚型单抗各2株，按照1.5项方法进行间接ELISA反应。根据A450值、adr A450/adw A450、adw A450/adr A450确定最佳HBsAg 包被剂量。用最佳剂量HBsAg包被96孔板，对筛选出的4株adr亚型单抗和2株adw亚型单抗进行鉴定。

1.7HBsAg亚型鉴别试验的验证由一组实验人员抽取并编盲adw⁃HBsAg和adr⁃HBsAg样品各2批（A、B、C、D），用最佳剂量HBsAg包被；由另一组实验人员用抗adr⁃HBsAg单抗和抗adw⁃HBsAg单抗检测盲样，按1.5项操作。后一组实验人员根据检测数据先行判别盲样亚型，前一组实验人员揭盲后确定编盲样品亚型与后一组实验人员检测的HBsAg亚型判别结果是否一致。

2结果

2.1单抗的筛选结果间接ELISA检测结果显示，1E9、3C10、3A5、3G8和1F8株单抗与adr⁃HBsAg 反应的adr A450/adw A450值均大于2，为抗adr⁃HBsAg 的单抗；1H6和4D3株单抗与adw⁃HBsAg反应的adw A450/adr A450值均大于2，为抗adw⁃HBsAg的单抗。见表1。

表1抗adr和adw亚型HBsAg单抗的筛选

Tab1.Screening of McAbs against HBsAg of subtypes adr and adw

A450

包被adr⁃HBsAg包被adw⁃HBsAg

1E9 3.2850.3828.5990.116 3C10 3.2850.4058.1110.123 3A5 3.4110.3878.8140.113 3G8 3.2850.4048.1310.123 1F8 3.1870.3688.6600.115 1H60.306>3.5000.08711.438 4D30.374>3.5000.1079.358单抗编号adr/adw adw/adr

中国生物制品学杂志2014年4月第27卷第4期Chin J Biologicals April 2014，Vol.27No.4

2.2鉴别试验抗原最佳包被剂量及单抗的鉴定结果ELISA 检测结果显示，当抗原包被剂量为10μg 时，A 450值适中，见表2，因此后续试验选取10μg 作为HBsAg 的包被剂量。抗体鉴定结果显示，3A5、3G8、3C10、1E9株单抗检测adr ⁃HBsAg 的adr A 450/adw A 450值均大于2，4D3和1H6株单抗检测adw ⁃HBsAg 的adw A 450/adr A 450值亦均大于2，见表3，表明抗体鉴

别两种HBsAg 亚型的效能良好。

2.3HBsAg 亚型鉴别试验的验证结果检测结果显示，1H6株单抗检测样品A 和B 的adw A 450/adr A 450值分别为5.587和4.595，均大于2，判定样品A 和B 为adw 亚型HBsAg ，两组人员的结果一致；1E9株单抗检测样品C 和D 的adr A 450/adw A 450值分别为4.385和4.305，均大于2，判定样品C 和D 为adr 亚型HBsAg ，两组人员的结果一致。见表4。4D3株单抗检测样品A 和B 的adw A 450/adr A 450值分别为2.157和

3.402，均大于2，判定样品A 和B 为adw 亚型HBsAg ，两组人员的结果一致；3A5株单抗检测样品C 和D 的adr A 450/adw A 450值分别为1.021和1.125，均小于2，adw A 450/adr A 450值分别为0.980

和0.8，亦均小于2，未能区分两亚型HBsAg 。见

表5。因此，抗adr 亚型单抗1E9株及抗adw 亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr 亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg 亚型的鉴别。

表2HBsAg 最佳包被剂量的选择

Tab 2.Optimization of dosage of HBsAg for coating

A 450

包被adr ⁃HBsAg 包被adw ⁃HBsAg

4D3100 1.812

3.265

100.133 1.2101

0.0450.5601H6100

1.684 3.185100.105 1.33210.0550.1971E9100 3.500 1.61810 1.00.07110.2180.0393C10

100

0.121 1.423100.0410.09910.0480.115阴性对照100

0.0470.053100.0500.0491

0.0480.048表41H6和1E9株单抗的验证结果

Tab 4.Verification of McAbs secreted by strains 1H6and 1E9

单抗

1H6（A 450）1E9（A 450）A 0.4330.0780.050 5.5870.179B 0.5220.1140.050 4.595

0.218C

0.0520.2280.054

0.228 4.385D

0.048

0.205

0.0500.232 4.305

阴性对照

（A 450）adw /adr adr /adw 包被抗原表3单抗的鉴定结果

Tab 3.Identification result of McAb

A 450

包被adr ⁃HBsAg

包被adw ⁃HBsAg

3A551.2950.283

0.100 4.5760.2193G8 1.096

0.287

0.092 3.8190.2623C10 1.1850.4050.050 2.9260.3421E9 2.0720.4940.0 4.1940.238

4D3

0.228

2.2810.00.10010.0041H6

0.213 2.390

0.080

0.0

11.221单抗编号阴性对照adr /adw adw /adr 单抗编号HBsAg 包被量（μg ）

表5单抗的验证结果Tab 5.Verification of MCAb

单抗

4D3（A 450）3A5（A 450）A 0.0960.0450.043 2.1570.4B 0.1570.0460.044 3.4020.294C

0.0490.0500.0460.980 1.021D

0.044

0.050

0.048

0.8

1.125

阴性对照（A 450）

adw /adr adr /adw 包被抗原546

··

3讨论

HBsAg为乙型肝炎疫苗的关键有效成分，有a、d/y 和r/w等抗原决定簇，可分为ayw、ayr、adw、adr等亚型，抗⁃“a”抗体对所有亚型的HBV感染均能提供保护性免疫［12］。HBsAg由226个氨基酸组成，adr亚型HBsAg与adw亚型HBsAg在氨基酸序列上的差异存在于第160位氨基酸，前者为赖氨酸，而后者为精氨酸［13］。各亚型间虽有共同“a”决定簇，但抗同一亚型的抗体组合抗该亚型的免疫保护效果最好。在adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中，急需建立有效的方法对其进行鉴别。

本实验共获得7株抗两亚型HBsAg的单克隆抗体，1H6和4D3株抗adw亚型HBsAg，其余的1E9、3C10、3A5、3G8和1F8株抗adr亚型HBsAg，经初步鉴定，各株单抗均能区分出两亚型抗原。在验证试验中，1H6株和4D3株单抗检测编盲样品A和B，adw A450/adr A450值均大于2，判定其为adw亚型HBsAg；1E9株单抗检测编盲样品C和D，adr A450/adw A450值均大于2，判定其为adr亚型HBsAg，与编盲样品A、B、C、D原始亚型一致；3A5株单抗检测编盲样品C和D的adr A450/adw A450值和adw A450/adr A450值均小于2，3A5株与两亚型抗原存在交叉反应，未能区分两亚型HBsAg。因此，抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。

目前的HBsAg EIA检测试剂是利用针对“a”共同决定簇的单克隆抗体，进行检测，两亚型HBsAg均能与之反应，亚型的差异未得到体现。本实验用特异的亚型单克隆抗体通过间接ELISA法对adr和adw 亚型HBsAg的鉴别进行了初步探索，由于共同抗原决定簇“a”是优势抗原决定簇，试验中存在一定的交叉反应，如以P/N≥2.1为阳性判定标准，则两亚型抗原反应孔均为阳性，不能区分两者，但其A值相差较大，因此尝试以A值之比大于2作为判定标准。

本实验解决了乙肝疫苗研制过程中亚型检定的困难，为加快adr亚型乙肝疫苗的研制提供了参考。

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收稿日期：2013⁃08⁃30编辑：何巍

547··