ELISA试验技术要点

（Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay,ELISA）

一、基本原理：

利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅，可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。该方法可对待测样品进行定性和定量分析，同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

目前使用的酶联免疫检测方法很多，应用较多的有：

间接法——用于测定抗体

双抗体夹心法——主要用于测定大分子抗原

竞争抑制法——主要用于测定小分子抗原

二、试验材料及试剂

酶标板（聚苯乙烯微量96孔板）

包被液（0.05M pH9.6 碳酸盐冲液）

无水Na2CO3                                    1.59g

NaHCO3                                       2.93g

蒸馏水定容至1000ml

洗涤液（0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液）

NaCl                                         8.0g 

KCL                                           0.2g

KH2PO4                                        0.2g

Na2HPO4•12H2O                               2.9g

吐温-20                                        0.5ml

蒸馏水加至1000 ml

封闭液

明胶                                        1g                  

包被液                                      100ml

抗体稀释液

明胶                                        0.1g

洗涤液                                      100ml

底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）

0.1M柠檬酸 (19.2g/L)                        24.3ml      

0.2M Na2HPO4 (28.4g/L)                       25.7ml

蒸馏水                                      50ml

TMB底物使用液

TMB储存液（100mg溶于10mlDMSO,40C保存）     0.1ml

底物缓冲液                                   10ml

30%H2O2                                       10ul

现用现配

终止液（2M H2SO4）

H2SO4（96%）                                22.2ml

蒸馏水                                       177.8ml

三、基本操作

1、间接ELISA

操作步骤如下：

包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4℃孵育过夜；

洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次；

封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔；

37℃孵育1h，洗涤同上

待检血清：加入适当稀释度的待测血清，0.1ml/孔；

             37℃孵育1h，洗涤同上

酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔；

37℃孵育1h，洗涤同上

底物：加入底物使用液，0.1ml/孔；

             37℃孵育15min

终止液：加入2M H2SO4，0.1ml/孔；

测定：终止后立即用酶标仪测定各孔OD 450nm。

2、双抗体夹心ELISA

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

包被酶标板：加适度稀释的抗体，0.1ml/孔，4℃孵育过夜；

洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次；

封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔；

             37℃孵育1h，洗涤同上

待检样品：加入适当稀释度的待测样品，0.1ml/孔；

             37℃孵育1h，洗涤同上

酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，0.1ml/孔；

37℃孵育1h，洗涤同上

底物：加入底物使用液，0.1ml/孔；

             37℃孵育15min

终止液：加入2M H2SO4，0.1ml/孔；

测定：终止后立即用酶标仪测定各孔OD 450nm。

3、竞争ELISA（测抗体）

操作步骤如下：

包被酶标板：加适度稀释的抗原，0.1ml/孔，4℃孵育过夜；

洗涤：倾去孔内的液体，在吸水纸上拍干，加入洗涤液，0.3ml/孔，洗涤三次，3min/次；

封闭：加入1％明胶，0.2ml/孔；

             37℃孵育1h，洗涤同上

待检血清：加入适当稀释度的待测血清与标准血清的混合物，0.1ml/孔；

             37℃孵育1h，洗涤同上

酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体（可特异性的与标准血清反应，不与待测血清反应）0.1ml/孔；

37℃孵育1h，洗涤同上

底物：加入底物使用液，0.1ml/孔；

             37℃孵育15min

终止液：加入2M H2SO4，0.1ml/孔；

测定：终止后立即用酶标仪测定各孔OD 450nm。

四、结果判定

在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔显色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔显色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下：

1、间接法和夹心法：

a.以P/N值表示：每批试验都需要阳性和阴性对照，求出样品的OD值与一组阴性样本吸收值的比值，即为P/N值，若比值大于2.1，则判为阳性。

b.以x+2SD表示：若样品的OD吸收值≥阴性样本的平均吸收值+2标准差，则判为阳性。

c.以滴度表示：将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本显色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

2、竞争法：用抑制率表示

　　抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：

　　抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值

　　一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。

注意事项

（1）酶标板的选择：目前常用的是96孔聚苯乙烯酶标板。不管何种载体，在使用前均需进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗体(或抗原)的选择：包被用抗体(或抗原)，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。另外还要考虑吸附温度，时间及其蛋白量对试验的影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值在1左右而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

（3）洗涤： ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在ELISA操作中，洗涤是很重要的关键步骤，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。通常是洗涤3次，每次3min，如果试验结果本底较高，可适当增加洗涤次数或延长洗涤时间。洗涤时在吸水纸上轻拍3－5次，将反应孔中的液体尽量拍干，动作不易过猛。洗涤液不要加的过满，如溢出可能造成孔间污染。

（4）加样：加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。加酶标二抗和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成，以免加样时间延误造成不必要的操作误差。

在ELISA试验中，加样量通常为0.1ml/孔，封闭液可适量增加，如0.2ml/孔，这样可使反应孔侧壁也被封闭，减少非特异性吸附。

（5）试验标本的保存：血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

　　血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。

    一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作。

（6）显色：显色液一定要先现用现配，以免过期的显色液影响试验结果。

（7）孵育：ELISA的实质就是抗原、抗体反应，所以试验的温度一般控制在37℃，即抗原抗体结合最适温度。多块反应板同时操作时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。

（8）每次试验，都要分别设阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。