紫草中水溶性成分提取,纯化以及鉴定

陈敏  黄志纾*

中山大学化学与化学工程学院，有机化学研究所，广州 510275

摘要  本文研究紫草中水溶性成分。通过改变水煮提取，索式提取和超声波提取这三种方法的反应时间，反应温度和反应时的水量比来确定水提取的最佳条件。再经过脱色，脱蛋白和衍生化处理后进行一系列定性鉴定，初步确定为结构较复杂的多糖。

关键词  紫草 水溶性 多糖 衍生化 脱蛋白

1  前言

紫草是紫草科植物的干燥根，性寒味甘，咸，入肝，心经，有清热凉血，解毒透淤等功效，用于血热毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，湿疹，水火烫伤等。经过前人的研究表明，紫草含有多种生理活性成分，这些成分具有抗菌，抗炎，抗癌，抗生育，抗甲状腺，抗免疫力低下，降血糖，保肝护肝等多种作用。就是因为它的多种功能，所以紫草一度成为国内外学者研究的热点。先前的学者大多研究的是紫草的脂溶性成分。傅善林等从紫草及其根的石油醚提取物中分离出萘醌色素类化合物。例如β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁（β,β-dimethylacrylalkannin），乙酰紫草素（acetylshikonin）,1-甲氧基乙酰紫草素（1-methoxyacetylshikonin）等等。这些成分已经得到深入研究，并取得一定成果[1]。

然而水溶性成分的研究却是前人未曾涉足的课题。而文献记载，古代人用紫草来医治梅毒，由于古代煎药都是用水，所以可以大胆推测紫草的水溶性成分可能有医治梅毒的作用。因此，我们所做的工作就是提取紫草水溶性成分，并进行初步的分离和鉴定。由于植物的含水量对植物内部化合物结构性质有影响，所以作者首先测定了紫草的含水量，这样对水溶性成分的测定有鉴定参考作用。然后用最常用的三种提取方法，即水煮提取法，索式提取法和超声波提取法，分别改变它们的提取时间，提取温度以及提取时的水量通过比较产率来确定提取的最佳条件，再将产品进行一系列定性鉴定，初步确定其为结构复杂的多糖

2  实验部分

2.1  试剂及原料

  紫草：广东省医药公司（产）；

  药品：2，4-二硝基苯阱，香草醛，1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮，feiling试剂等；

试剂：正丁醇，三氯甲烷，乙醇，乙酸异戊脂等均为分析纯，广州化学试剂一厂；

2.2  实验仪器

旋转蒸发仪，ES52C, 上海亚荣生化仪器厂；岛津LC-6A高效液相色谱仪；PERKIN-ELMER1700红外光谱仪；UV-265型紫外-可见分光光度计。

2.3  实验方法

2.2.1  紫草含水量测定

将粉碎了的紫草装于培养皿里置于烘箱，测定在T=100℃，不同时间下烘前与烘后产品（连同培养皿）质量差，从而能较为准确地得出紫草的含水量。见表1。

2.2.2  不同提取方法

我们采用水做溶剂来提取。为了得到最佳提取方法。我们选择索式提取，水煮回流提取及超声波提取三种方法通过改变条件进行提取。

实验一:固定水煮温度为100℃（索式提取与超声波提取不受温度影响）并固定各方法的水量比（1:100），其中水量比（w/w）=样品量:水量。取4g粉碎了的紫草与400ml水置于500ml的圆底烧瓶。改变时间来提取。见表2

实验二:水煮提取固定时间t=10h，固定水量比（1:00），所用样品为4g。改变温度来进行提取。见表3

实验三:水煮和超声波两种方法在各自的最佳条件下改变水量比，所用产品均为2g。见表4

2.2.3  紫草提取的后处理及样品的脱蛋白

先将溶液过滤除去紫草渣，然后加5%的活性炭[2]脱色，煮沸3-5分钟。再过滤，蒸馏至一定体积，剩下的溶液与乙醇用1:5的体积混合，冷冻静置过夜即可得絮状沉淀，然后再旋转离心，去掉上层清夜，固体放在红外灯烘干即可得产品。再进行称量比较产量。取少量样品，用去离子水溶解。取粗产品溶液4ml与氯仿-正丁醇（4:1）混合液1ml，混合充分振摇30min，离心1min，再将水相与氯仿相分开，此过程重复4-5次，再以离子水为空白溶液作紫外测定[3]。 

2.2.4  定性测定。见表5

共采用了成刹法，显色法，feiling试剂法，红外测定[4]以及样品衍生化后测HPLC等方法。

衍生化步骤：将干燥过的大约0.01g的待测样品置于小试管里，依次加入100ulPMP溶液1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮（0.5mol/l甲醇溶液）和100ulNaOH（0.3mol/l）,混匀后混于70℃水浴中加热反应30min,取出室温放置10min,再加入125ul盐酸溶液（0.3mol/l）, 中和，混匀后用2.5ml乙酸异戊脂萃取，涡旋3min，离心15min，小心弃去有机层，再萃取一次得下层，加水750ml混匀并离心15min，用于HPLC分析。标准液为同样步骤衍生化后的葡萄糖，蔗糖，麦芽糖[5]。

3 结果和讨论

3.1  含水量测定

可得紫草含水量为13.8%。

表1：固定温度，改变时间测定含水量

索式提取的基本原理是水蒸气遇冷凝结所落下的水珠（水珠的温度一般为50℃-60℃）洗脱样品而得到产品，所以它不受提取温度和水量的影响。而超声波也不受温度影响。所以只有水煮需要进行温度测定。而根据数据，产率随着水量比例的提高而增多，所以可得出结论，水溶剂增多有利于产率提高。其中产率=提取产品/原料。由于实验条件有限，故只做到1:250的比例。数据表明了在T=100℃下于水量比例为1:250时的水煮提取为最佳实验条件。其原因估计为物质在水的溶解性受温度的影响较提取时间和水量比大，故温度为主要影响因素。

表2：改变时间，比较各方法提取的产率

3.3 脱蛋白处理后，从紫外图可看出，原本在波长为300nm左右的峰不见了，可见蛋白已除.。一般的蛋白波长都在280nm，移至300nm的原因可能是测定时的参比溶液的误差。应该用含有除了样品成分而具有其他成分的溶液做参比，而不应单纯用去离子水。

3.4 定性鉴定

表5：定性鉴定的方法和现象

以上现象都证明了糖的存在，而从红外图更可看出，有多糖的羟基峰和特征峰。可判断为多糖。在实验过程中，第一次完全溶而析出的沉淀再次溶出时并不完全，估计除了部分杂质外，还因里面的糖发生了角脂化。而由于活性炭的量，PH值，脱色温度，脱色时间都会影响产率及物质结构，在分析其结构时要将这些因素考虑进去。本实验初步鉴定了紫草里的水溶性成分，确定其为结构非常复杂的多糖，具体结构还有待以后研究。

致谢  衷心感谢古练权老师、黄志纾老师、马林老师以及吴海强师兄在实验过程中对我耐心的教导与帮助，并感谢创新基金对本实验提供的资助。

参  考  文  献

1陈发奎.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民卫生出版社,1997：732-732

  严松柏,谈献和,胡玉涛.紫草的研究进展.时珍国医国药,2003.14(2)

2孙颉,何慧,谢笔钧.活性炭脱色对灵芝水提液活性成分的影响.化学工业与工程技术.2001.22(1)

3刘成梅,万茵,涂宗财等.百合多糖脱蛋白方法的研究.食品科学,2002,23(1):

  徐建祥,宴志云,赵谋明等.食品与发酵工业,24(3)

4.哈森其木格,贺锋嘎,周晓军.芥菜多糖的研究-水溶性芥菜多糖的提取纯化和部分理花性质的鉴定.内蒙古民族学院师院学报（自然科学报）,1994.9(2)

高居易等.紫孢侧耳多糖的提取，纯化及性质的研究.福建师范大学学报（自然科学版）,1999.15（2）:83-87

5马定远,陈君,李萍等.柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成.分析化学研究简报,2002.30（6）:702-705  

Studies on the Water-Soluble Chemical

Constituents from ChineseMedicine “zicao” 

Min Chen   Zhi-shu Huang *

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongshan University, Guangzhou 510275)

Abstract  In this paper, the chemical constituents solved in water of  Chinese medicine “zicao” (the roots of Arnebia euchroma (Royle) Johnst.) were studied and qualitative analysized.The different extraction methods were used for finding out the optimism procedure.A series of analysis after decoloring, deproteining, and derivating showed preliminaryly this water soluble constituent as complex polysacckaride..

Keywords Zicao(roots of Arnebia euchroma (Royle) Johnst.),water-solubility, amylose，derivative，de-albumen