花色素的提取分离

1.了解原花色素及其分离提纯的常用方法。

2.学会用乙醇抽提法提取分离花色素和比色法测定其含量。

二、实验目的

原花色素，也称原花青素（proanthocyanidins）,是一类从植物中分离得到的在热酸条件下能产生花色素的多酚化合物，它既存在于多种水果的皮，核和果肉中，如葡萄，苹果，山楂等。也存在于如黒荆树，马尾松，思茅松，落叶松等的皮和叶中。

原花色素属于生物类黄酮（flavonoids）,它们是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成，最简单的原花色素是儿茶素的二聚体，此外还有三聚体，四聚体等。依据聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚体，而五聚体以上的称为高聚体。从植物中提取原花色素的方法一般有两种，分别是用水抽提或用乙醇抽提。其抽提物为低聚物，称之为低聚原花色素（oligomeric proanthocyanidins,简称OPC）。

三．实验仪器

 1.试剂：花色素标准样品；甲醇；0.1%HCL-95%乙醇（V:V=70:30）；无水乙醇；石油醚；乙酸乙酯；HCL-正丁醇（浓HCL5.0ml加入正丁醇95.0ml，混合即可）；2%硫酸铁氨（硫酸铁氨2.0g溶于2.0mol/L HCL 100.0ml即可）

 2.器材：冷冻干燥机；旋转蒸发仪；分光光度计；水浴锅；电炉；电子分析天平

3.材料：新鲜勒杜鹃花

四、实验操作

(一)勒杜鹃原花色素的提取

1.材料处理：

称取新鲜勒杜鹃10.0g，剪碎，置于锥形瓶中，加入3倍体积的石油醚，室温浸泡，脱去脂质物质和叶绿素，过滤，将勒杜鹃样品晾干，备用。

a)花色素的提取：提取剂0.1%HCL-95%乙醇（V：V=70:30）料液比（m：V=1:150），提取时间30分钟，控制提取温度60℃，提取次数2次，即提取液分2次加入。

2.花色素的纯化：由于样品中还是会含有其他杂质，如：蛋白质，维生素（水溶性维生素易溶于水而不易溶于非极性有机溶剂；脂溶性维生素易溶于非极性有机溶剂，而不易溶于水。）往粗提液中加入2倍体积的乙醇，过滤，除去变性的蛋白质，在往里加入石油醚、乙酸乙酯除去水溶性维生素、脂质、叶绿素和多酚等杂质，弃有机溶剂剂层。

3.花色素的冷冻干燥：置提取液与旋转蒸发仪、冷冻干燥机中浓缩干燥后即是待测花色素样品。

4. 花色素标准样品溶解（1.0mg/ml）：精确称取花色素标准样品10.0mg，用甲醇溶解，定容至10.0ml备用。

5. 花色素样品溶解：将分离得到的花色素样品，用甲醇溶解定容至25.0ml，试样浓度控制在1.0-3.0mg/ml。

6. 标准曲线制备：去干净试管8支，按下表进行操作。以吸光度A546为纵坐标，花色素含量（μg）为横坐标作图得标准曲线。

表：HCL-正丁醇测定花色素含量标准曲线绘制

8.待测花色素样品含量测定：吸取样品0.10ml加入试管（平行做两份），个补加甲醇0.4ml，在分别加2%硫酸铁氨溶液0.1ml和HCL-正丁醇溶液3.4ml，沸水浴中煮沸30min，冷却至室温后，15min内以上表的0号管为参比溶液在波长546nm处测定个管吸光度。根据测得的吸光度从标准曲线上查出待测样品液中花色素含量（μg）。

五．结果处理

1.常用溶剂的极性顺序

水(最大）>甲酰胺>三氟乙酸>DMSO>乙腈>DMF>六甲基磷酰胺>甲醇>乙醇>乙酸>异丙醇>吡啶>四甲基乙二胺>丙酮>三乙胺>正丁醇>二氧六环>四氢呋喃>甲酸甲酯>三丁胺>甲乙酮>乙酸乙酯>三辛胺>碳酸二甲酯>乙醚> 异丙醚>正丁醚>三氯乙烯>二苯醚>二氯甲烷>氯仿>二氯乙烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油（石油醚）(最小)

2.盐酸乙醇溶液是常用的非水成盐溶液。用于一些碱性有机物的成盐反应，因为有机物常常不容于水而易溶于乙醇等有机溶剂 ，如有机胺类。http://baike.baidu.com/link?url=hT_ob_fh9iHuJOAnZlAxVa6YCsquIPcBu-savablbgu5nA36Ce_mbQ3GF6a_iiud