分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数

（目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理） 

一、实验重点

1、掌握本实验的基本原理。 

2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。 

3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。 

二 、实验难点 

1、葡萄糖标准曲线的绘制

2、反应实验条件的控制

三、注意事项 

1、分光光度计使用注意事项： 

(1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。 

(2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。 

(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。 

(4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。 

(5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器 

2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确

3、反应条件要严格安要求控制

四、思考题回答 

1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？

  米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。 

    Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下： 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。 

它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。 它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。

2、为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？

  米氏方程式是根据中间产物理论推导出来的。即在酶催化反应中，酶（E）和底物（S）首先生成中间产物（ES），然后分解成产物（P）和游离酶（E）： 

    （1） 

、、代表反应各步的速率常数。当反应以恒态进行时，ES的生成速率等于分解速率，即

      （2） 

式中、和分别代表酶、底物和中间产物的浓度。令 

                      （3） 

设反应前酶的初始浓度为,则 

                      （4） 

由（3）和（4）式得： 

                        （5） 

    当酶的浓度一定时，测定的是底物反应的初速率，那么由SP的反应速率为，但在反应方程式（1）中，ES的分解速率很慢，这一步成了总反应的决定步骤，则有 

                           （6） 

在反应开始阶段，底物浓度的增加，反应速率也随着增加；当增加到过剩时，进一步增加不再影响反应速率了，即达到。此时绝大部分酶与底物都结合了。可近似地看作,则有： 

因此测定酶的米氏常数要采用初始速率法。 

3、试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。

  米氏常数的测定结果准确与否与酶的活性有莫大的关联而酶是一种活性蛋白质，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性，同时也影响着米氏常数的测定。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。 

(一) 温 度 

    酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右。通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。 

(二) pH值 

    pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。各种酶的特异性表明，酶的活动中心只能结合带某种电荷的离子，包括正电、负电或两性电荷。酶分子具有两性电解质的性质，同时pH值也改变了酶分子的带电状态，特别是改变了酶活力中心上有关基团的电离状态。当在某一pH时，酶分子的活动中心，既存在一个带正电的基团，又存在一个带负电的基团，这时，酶与底物结合最容易；当pH偏高或偏低时，其活动中心只带有一种电荷，就会使酶与底物的结合能力降低。例如，蔗糖酶当处于等电点时，才具有酶活性，而在等电点的偏酸或偏碱的一侧，酶活性则降低甚至完全丧失。 

(三) 酶的浓度和底物浓度 

    酶与底物浓度的关系，一般来说，当酶的浓度较小，底物浓度大大高于酶，则酶的浓度与反应速度成正比；当底物浓度一定时，酶的浓度继续增加到一定值以后，其反应速度并不加快。