Small RNA测序研究miRNA海参免疫的机制

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Scientific Reports

海参是棘皮动物门、海参纲动物的统称，

海洋底栖生物能在高浓度病原体微生物环境中生存有其特有的免疫机制。其免疫应答由参与免疫反应的效应细胞-体腔细胞和多种体液免疫因子共同介导。《本草纲目拾遗》中记载其味甘咸，补肾，益精髓，其性温补，足敌人参。

海参不仅药用价值广，其商业价值也高居不下，并且为当今饕餮大餐中不可或缺的一员。

大连海洋大学张峰教授团队通过 Small RNA 测序研究miRNA海参免疫的机制，

分析了 miRNA 家族中的 miR-137 的结构及进化，

研究成果发表于2015年12月的 Scientific Reports（IF：5.578），

其中 Small RNA 测序工作由诺禾致源完成。

研究方法

1 miRNA 长度筛选

分析 miRNA 的长度分布，主要分布在 21-23 nt。其中 A06 中的有多个 miRNA 分布在 27-29nt，经分析多是 scnRNA。图1 三个样本中的sRNA长度分布

3 miRNA的家族分析

3.1 对其中的 miRNA-137 结构进行研究，发现它的第一个碱基 2-8nt 确实与脊椎动物中的 miRNA-137 高度保守，由于 miRNA 是依靠2-8位碱基进行靶基因识别，因此此高度保守序列导致其 spu-miR -137 功能与脊椎动物中的 miR-137功能一致。

3.2 选取脊椎动物和无脊椎动物的 miR-137 序列进行进化分析，发现棘皮动物的 miR-137 和节足动物来自同一个祖先。2 新miRNA预测

通过分析三个海参样品中的 miRNA，发现有38个 miRNA，并通过软件预测出3个新的 miRNA，其中 spu-mir-2004、spu-mir-2005 仅在棘皮动物中存在。

图2 miRNA的结构预测

图3 miR-137结构分析

4 miRNA 表达水平分析

通过 miRNA 表达水平分析进行聚类，绘制热图。发现在三个海参样品中主要有三种表达模式：（1）在 A06 和 A12 中都高表达；（2）仅在 A06 中高表达；（3）在 A00 和 A12 中高表达。本研究在着重于 miRNA 靶基因预测，从结构入手，分析样本中 miRNA 的二级结构及其进化。研究证实了 miR-137 是一个在多个物种中普遍存在并参与免疫活动的 microRNA 家族，

对这一家族的序列比对分析有助于揭示免疫进化机制。

另外，比较发现无脊椎动物与脊椎动物的 miR-137 序列大体相同，但是在对于 miRNA 识别功能极为重要的前十位碱基上有两处不同。

该研究成果对深入揭示棘皮动物免疫机理具有重要的意义。

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结论与讨论

图4 miR-137的进化分析图6 LPS处理不同时间后海参中C3的表达水平

图5 miRNA的聚类热图

5 qPCR检测C3表达量

研究认为，多数差异表达的 miRNA 的靶基因功能与免疫应答相关，其中以补体 C3 的功能最为相关。研究人员对LPS处理后不同时间的样本中的补体 C3 进行 qPCR，发现在 LPS 处理 这个免疫过程中，miRNA 起着主要的作用。

实验组取 10mg LPS溶于 5ml 无菌海水中，注射0.5ml LPS 液体；而对照组注射 0.5ml 无菌海水取LPS处理后 6h（A06）、12h（A12）的体腔细胞及对照组（A00）海参的体腔细胞检测

构建cRNA文库（140-160bp）取 材

建 库测 序

Illumina HiSeq 2500 SE50