微生物实验指导-

广西大学行健文理学院

生物工程教研室

二〇一一年八月

目录

实验一  环境中的微生物  ……………………………………………………………3

实验二  显微镜的构造、性能及使用和细菌单染色、革兰氏染色…………………5

实验三  细菌荚膜、芽孢染色  ………………………………………………………11

实验四  印片法观察放线菌形态………………………………………………………13

实验五  霉菌的形态观察………………………………………………………………14

实验六  培养基的制备和灭菌  ………………………………………………………15

实验七  从土壤中分离细菌、放线菌和真菌及其平板菌落计数……………………17

实验八  多管发酵法检测水中大肠菌群………………………………………………20

实验九  微生物显微直接计数…………………………………………………………23

实验十  微生物细胞大小的测量………………………………………………………27

实验十一  紫外线照射杀菌实验………………………………………………………30

实验十二  呼吸缺陷型酵母筛选………………………………………………………32

综合实验  乳酸菌的分离筛选与乳酸饮料……………………………………………34

实验一  环境中的微生物

一、实验目的和内容

目的：1.了解环境中微生物的分布

2.建立无菌操作观念，学习平板倒制方法。

内容：1.倒制平板。

2.对平板做不同的处理，以检测环境中的微生物。

二、基本原理

平板培养基含有微生物生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在 28～37 ℃ 温度下培养，2～4 天内每一菌体即能通过很多次细胞而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种微生物所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。

三、器材

1.培养基    牛肉膏蛋白胨固体培养基

2.仪器或其他用具    无菌平皿    接种环    试管架    酒精灯    记号笔

四、操作步骤

1. 倒制平板

融化培养基，冷却至60℃左右，以无菌操作方法倒制平板。每组倒制4~5个。

倒培养基时，右手持盛有培养基的三角瓶于火焰旁，左手将瓶塞轻轻拔出，用右手小指和无名指夹住瓶塞，瓶口保持对着火焰。左手中指和无名指托住平皿底，拇指和食指配合小心将平皿打开一个缝隙，迅速倒入适量培养基并盖好皿盖，沿着实验台的边缘将平皿平推入台面。

2.空气中微生物检查

（1）实验室空间中空气    将一个牛肉膏蛋白胨平板放在当时做实验的实验台上，移去皿盖，使培养基表面暴露在空气中，过30分钟后，再将皿盖盖上。

（2）实验室近地空气    将另一平板放在实验室通道旁地板上，移去皿盖，使培养基表面暴露在空气中，过30分钟后，再将皿盖盖上。

3.手指上微生物的检查

在一个平板的皿底划线，按照小组人数将平板划分成几个区域，打开皿盖，每个成员用手指头分别在对应的区域轻按，之后将皿盖盖上。清洁手部后，再在另一个平板上分别按上手指印。做好标记。

4.自来水中微生物的检查

将一个平板的皿盖打开，滴入一滴自来水后盖上盖子，轻晃平板，使水滴散开，放至一旁，直至水被吸收。

5.培养

将本小组的平板叠在一起，倒置于恒温培养箱中，30℃培养2~3天后取出观察。

6.观察结果并记录

（1）菌落计数。    

（2）根据菌落的大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。

1.实验室空间空气与近地空气相比，平板上菌落数与菌落类型有何区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

2.无菌操作的要点是什么？为什么要这么做？通过本次试验，在这方面你有何体会？

3.为什么平板要倒置培养？

实验二    显微镜的构造、性能及使用

和细菌单染色、革兰氏染色

一、实验目的和内容

目的：1.熟悉明视野显微镜的结构和原理，掌握显微镜的使用方法。

2. 能熟练进行简单染色的操作，掌握革兰氏染色操作技术，能用油镜观察染色标本。

内容：1.熟悉显微镜的结构和油镜的工作原理。

2.对大肠杆菌进行简单染色。

3.对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色。

4.用油镜观察标本。

5.显微镜用完后的处理。

二、基本原理

（一）显微镜的结构 

明视野显微镜由机械部分和光学部分组成。  

1．机械部分 

（1）镜筒  位于显微镜上方。上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，多为斜筒式。 

（2）镜臂  为弓形金属柱，支持镜筒。 

（3）镜头回转器  装于镜筒下端，用于安装物镜和转换物镜。 

（4）载物台  物镜下的平台，用以载放被检标本。有通光孔，供入射光通过。载物台上，以片夹固定标本，或以标本推动器将标本固定后，前后左右推动，找寻不同观察视野。 

（5）调节器  为调节焦距的装置，有粗调节器和细调节器两种。利用它们使镜筒或载物台上下移动，调节物镜与标本间距离，使物像更清晰。有的显微镜还有专司聚光器升降的调节器。 

（6）镜座  位于显微镜底部，支持全镜。 

2．光学部分 

（1）目镜  可将物镜所成实像进一步放大，但不增加分辨力。目镜上标有5×、10×、15×等，各代表其放大倍数。 

（2）物镜  是显微镜中决定成像质量和分辨能力的重要部件，其作用是将标本放大。物镜上常标有放大倍数、数值口径等参数。物镜根据使用条件不同，一般可分为干燥物镜（包括低、高倍镜）和浸油物镜（100×）。 

（3）聚光器  位于载物台下方。其作用为将入射光聚集于标本之上。聚光器位置升降可影响视野的明亮度。 

（4）光圈  安装于聚光器下方。由十几张金属薄片组成，可通过放大和缩小调整透进光强弱，调节对比度。 

（5）光源  分为两种。一种为反光镜，可采集外来光线并送入聚光器。有平、凹两面之分。通常用平面镜，在照明条件较弱或用油镜时，采用凹面镜。另一种为安装在镜座内的内置光源，亮度可调。 

图2-1  显微镜的结构

（二）油镜的使用与保护 

1．油镜的原理 

微生物标本的检查，常用显微镜进行。其中细菌体积微小，以μm计，必须用油镜才能分辨清楚。 

显微镜的分辨力，即其分辨两点之间最小距离（R）的能力，由作用光波长（λ）和物镜的数值口径（N.A.）决定。  

明视野显微镜以可见光为光源，波长平均值固定在550nm左右。所以只能通过增加物镜的数值孔径（N.A.）来提高显微镜分辨力。N.A.表示由聚光镜而来的锥形光柱照射在观察标本上被物镜聚集的量。

N.A.=n·sin（θ/2） 

       图2-2  物镜的镜口角                图2-3 油浸的作用示意图

其中θ为镜口角（图2-2），指通过标本的光线投射到物镜的角度。其理论限度在180°，一般最大角度为120°，所以 sin（θ/2） 总小于1。n指物镜与标本间介质的折射率。干燥物镜所用介质为空气（n≈1），入射光通过标本玻璃（n=1.52）后，在空气中发生折射，部分光线散失。故N.A.不超过1。而油镜以香柏油为介质（n=1.52，与玻璃相近），镜头工作时浸入油内，可消除光线通过玻璃与物镜间空气时发生的折射现象，避免光线损失（图2-3），故油镜数值口径得到较大提高（可达1.25），显微镜的最小分辨距离也达到约0.2μm，几乎可看清所有细菌。 

2．油镜的使用步骤 

（1）观察前准备 

一手握镜臂，一手托住镜座，取出显微镜置于平稳实验台上。镜座距实验台边沿约3-4cm。镜检者姿势端正，两眼睁开，以减少疲劳。一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录。手不可直接触摸镜头，可用擦镜纸擦去镜头灰尘。 

（2）采光  

将低倍镜转到光路中，适当调节光圈和聚光器，打开内置光源，使视野得到均匀照明。注意：当用油镜观察标本时，光线宜强，可完全打开光圈，上升聚光器与载物台相平。 

（3）观察 

通过低倍镜调节入射光线，使视野最明亮。从二重瓶内瓶中取香柏油1-2滴滴于标本片上要观察的部位。标本固定于载物台上，转换为油镜。双目侧视下，转动粗调使油镜头浸入油中几乎与标本相接触。然后左眼从目镜观察，徐徐下调载物台，直到看见模糊物像，再用细调节器调至物像清晰，观察标本，绘图。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。注意：非在侧目注视下，不可使油镜与标本接近，以免压碎玻片，损坏镜头。 

3．显微镜用毕后的处理 

（1）以粗调节器调开油镜，移去标本片。 

（2）用擦镜纸擦去油镜上的香柏油。如油过粘、过干，可以擦镜纸沾少许二重瓶外层的二甲苯擦镜，然后立即用干擦镜纸擦去残留二甲苯，以免镜头脱胶。 

（3）加少许二甲苯于滴过油的标本上，以毛边纸向一个方向轻轻拖拉，除去标本上的油。一次不行可重复，但不可来回擦抹，以免擦掉标本。 

（4）将显微镜各部分还原：关闭光源，聚光器下降，物镜镜头离开通光孔上方转成八字形。放入镜箱。

（三）细菌的单染色、革兰氏染色

由于细菌微小，加之它与周围的水环境光学性质相近，从而用一般光学显微镜不易看到它。通常用染色的方法增加反差，有助于细菌标本的观察。染料有带阴离子发色团的酸性染料和带有阳离子发色团的碱性染料。由于在一般生理条件下（pH7.4左右）细菌菌体都带负电荷，从而更容易与碱性染料相结合。常用的碱性染料有结晶紫、美蓝和碱性复红。 

染色法又分单染和复染色两大类。单染色法即仅用一种染料着色，所有的细菌均被染成一种颜色，可用来观察细菌的形态和排列方式，但无鉴别细菌的作用。复染色法又称鉴别染色法，通常用二种或二种以上的染料着色，由于不同种类的细菌或同种细菌的不同组成结构对染料有不同的反应性而被染成不同的颜色，从而有鉴别细菌的作用。 

三、器材

1.仪器或其他用具：显微镜    载玻片   接种环   酒精灯  记号笔   蒸馏水   刀片

2.试剂：复红染液   革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液等）  二甲苯

3.菌种：大肠杆菌   金黄色葡萄球菌    芽孢杆菌   

四、操作步骤

（一）细菌简单染色

1.涂片：取一块载玻片，中间滴一滴蒸馏水，用接种环以无菌操作方式从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂开。

2.干燥并固定：于空气中自然干燥，或将玻片在酒精灯上部通过火焰3~4遍，注意温度不要太高，以热而不烫为宜。

3.染色：滴加复红染液，1min后，用水洗去多余染料。

4.镜检：自然干燥、滤纸吸干或酒精灯火焰加热加速干燥，油镜镜检并记录观察结果。

（二）细菌的革兰氏染色

1.涂片：取一块玻片，用记号笔从中间将其一分为二，并分别做记号。在两边分别滴一滴蒸馏水，以无菌操作方式用接种环分别从芽孢杆菌斜面和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于左右两滴水滴中，混匀，涂开。

2.干燥并固定：于空气中自然干燥，或将玻片在酒精灯上部通过火焰3~4遍，注意温度不要太高，以热而不烫为宜。

3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，1min后，用水洗去多余染料。

4.媒染：滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。

5.脱色：滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至流出液不带有紫色为止（约15~30S），立即用水冲洗。

6.复染：滴加番红复染液复染1min，水洗。

7.镜检：干燥后，油镜镜检并记录结果。

五、思考题

1.当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？

2.影响显微镜分辨率的因素有哪些？

3.涂片后为什么要进行固定？固定时要注意什么？

4.革兰氏染色的关键步骤是什么？

5.当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证结果可靠？

实验三    细菌荚膜、芽孢染色

一、实验目的和内容

目的：1. 熟悉芽孢染色的方法。

2. 熟悉荚膜染色的方法。

内容：1.枯草芽孢杆菌芽孢染色。

2.荚膜产生菌荚膜染色。

3.用油镜观察。

二、基本原理

芽孢是一些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，壁厚、透性低、不易着色。用着色力强的染色剂如孔雀绿或石炭酸复红在加热条件下能进入菌体和芽孢内，进入菌体的染料经水洗后脱色，而芽孢内的燃料难以洗脱，从而对芽孢进行染色。

荚膜是一些细菌细胞外的一层胶状黏液物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料亲和力低。通常采用衬托染色法染色，使菌体和背景之间形成一透明圈。

三、器材

1.仪器或其他用具：显微镜    载玻片   接种环   酒精灯  记号笔

2.试剂:复红原液  孔雀蓝   二甲苯

3.菌种:钾细菌  枯草芽孢杆菌

四、操作步骤

（一）细菌荚膜染色

1.涂片：以无菌操作方式从钾细菌平板中挑取少许菌苔涂至干净的载玻片中间，轻轻涂开，自然干燥。

2.染色：滴加复红原液覆盖于干燥的菌苔上，2～3S后马上用水冲洗。

3.镜检：玻片干燥后用油镜观察并记录结果。

（二）细菌芽孢染色

1.涂片：在干净的载玻片上滴加一小滴无菌水，以无菌操作方式从枯草芽孢杆菌斜面中挑取少许菌苔在水中混匀并涂开，干燥。

2.染色：滴加3～4滴孔雀绿染液于涂片上，用试管夹夹住载玻片一端在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中注意勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

3.冲洗：倾去染料，待玻片冷却后，用自来水冲洗到孔雀绿不再褪色为止。

4.复染：用复红染液复染1min，水洗。

6.镜检：玻片干燥后用油镜观察并记录结果。

五、思考题

1.为什么芽孢染色要加热？

2.为什么在荚膜染色中不用热固定？

3.为什么荚膜染色要用负染色法？

实验四  印片法观察放线菌形态

一、实验目的和内容

目的：1.掌握印片法制片技术。

2.观察放线菌的个体形态。

内容：1.印片法制作放线菌标本。

2.用油镜观察。

二、基本原理

放线菌是一类原核单细胞型微生物，细胞的基本结构类似于细菌。放线菌具有丝状分枝，形成基内菌丝、气生菌丝和顶端部分分化而成的孢子丝，孢子丝断裂形成孢子。孢子丝可呈螺旋状、波浪状或分枝状等，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子呈圆形、杆型和椭圆型等，且具有各种颜色。气生菌丝及孢子的形态和颜色常作为放线菌分类和鉴定的重要依据。 

通过设计各种培养和观察方法如印片法、插片法、玻璃纸法等，可保持放线菌自然生长状态下的形态特征，便于观察放线菌菌丝和孢子形态。

3、器材

1.仪器或其他用具：显微镜    载玻片   接种环   酒精灯  记号笔   蒸馏水   刀片

2.试剂：复红染液   二甲苯

3.菌种：大肠杆菌   金黄色葡萄球菌    芽孢杆菌     放线菌

4、操作步骤

（三）印片法观察放线菌形态

1.取两块载玻片，用刀片在放线菌平皿中取出约0.5cm×0.5cm的一小块培养物（连培养基一起），放到其中一块载玻片上，将另一块在火焰上稍微加热并盖在培养物表面，轻压一下后拿起来并反转，将印痕处通过火焰2~3次固定。

2.染色：在印痕处滴加复红染液，染色1min，水洗。

3.镜检：玻片干燥后用油镜观察放线菌菌丝、孢子形态并记录结果。

五、思考题

1.印片法制片时，有何应注意的地方？

2.观察放线菌形态时，为什不采用涂片法制片？

实验五    霉菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：1.掌握霉菌制片技术。

2.观察霉菌的个体形态。

内容：1.压片法制作霉菌标本。

2.用高倍镜观察。

二、基本原理

霉菌为真核细胞型微生物，大多数为多细胞，具有分枝状菌丝体，菌丝较粗，孢子有各种不同的形状，可分为有性孢子和无性孢子。

由于霉菌菌丝较大，且孢子易飞散，一般将其置于乳酸酚棉兰溶液中，菌体和孢子染成蓝色，使保持菌丝原形，细胞不易干燥，并有杀菌防腐作用。为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态，还可采用湿室载片培养法或玻璃纸透析培养法制备标本片。

三、器材

1.仪器或其他用具：显微镜    载玻片   接种环   酒精灯  记号笔  刀片

2.试剂: 乳酸酚棉兰

3.菌种:根霉

四、操作步骤

1.制片：在载玻片上滴加一滴乳酸酚棉兰染色液或蒸馏水，用刀片从根霉菌平板上孢子产生较丰富区域挑取少许菌丝置于载玻片上，用接种环将菌丝分散开，盖上盖玻片。注意不要产生气泡。

2.镜检：用低或高倍镜观察根霉孢囊、孢囊孢子、匍匐菌丝、假根等形态，并绘图。

五、思考题

1.放线菌和霉菌的菌落有何不同？

2.根霉的个体形态有何特点？

实验六    培养基的制备和灭菌

一、实验目的和内容

目的：1.掌握培养基配制的方法。

2.了解高温消毒及干热灭菌的原理和方法，熟悉培养基灭菌的方法。

内容：1.配制蛋白胨牛肉膏培养基、高氏一号培养基。

2.培养基灭菌。

二、基本原理

培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。

灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体。

在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养，不能有其他杂菌，因此，对所用的器材、培养基要进行严格的灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。加热法又分为干热灭菌和湿热灭菌。培养基的灭菌最常用的是高压蒸汽灭菌法（属于湿热法），主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。

高压蒸汽灭菌比干热灭菌所要求的温度低、时间短，因为高压蒸汽灭菌属于湿热灭菌，杀菌效力比干热大。主要是：一、湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质交易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固稳度降低；二、湿热的穿透力比干热大；三、湿热的蒸汽有潜热存在，每1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。所以高压蒸汽灭菌比干热灭菌所要求的温度低、时间短。

三、器材

1.仪器或其他用具：灭菌锅  三角瓶  试管  漏斗  弹簧止水夹  硅胶塞  搪瓷杯 药匙  称量纸  牛皮纸

2.试剂:牛肉膏  蛋白胨  琼脂粉  可溶性淀粉  KNO3、MgSO4·7H2O  K2HPO4 7H2O  FeSO4  NaCl  1mol/LNaOH  1mol/LHCl

四、操作步骤

(一)培养基的制备

1.选定培养基配方。

2.称量：根据配方称量各种药品，放入搪瓷杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

3.溶解：向搪瓷杯中加入少量需要的水量，用玻棒加以搅拌，也可以同时在电磁炉上小心加热溶解，待药品完全融化后定容，补足水分。若配制固体培养基，则在加热融化过程中需不断搅拌，以防止琼脂糊底或溢出。

4.调pH：待培养基冷至50~60时检测其pH，如不在所需要的pH范围内，则滴加1mol/LNaOH或 1mol/LHCl进行调节，调节过程中要注意搅拌，不要调过头，以免回调影响各离子浓度。

5.分装：按照实验要求将配制的培养基分装至三角烧瓶、试管等，分装时可用漏斗，以免培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后摆斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的1/2为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

6.加塞，包扎，写标签，送灭菌。

7.摆斜面：如制斜面，需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调节斜度，使斜面长度不超过试管长度的1/2。

8.无菌检查：将将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用，贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（二）灭菌

五、每组需准备的材料

1.制备培养基的原则和方法步骤是什么？

2.培养基为什么要灭菌？干热灭菌可否用于培养基灭菌？为什么？

实验七   从土壤中分离细菌、放线菌和真菌

及其平板菌落计数

一、实验目的和内容

目的：1. 掌握从土壤中分离微生物的方法。

2.掌握用平板菌落计数法测定微生物数量的方法。

3.掌握不同微生物菌落特征，在培养平板上区分不同微生物。

4.学会正确使用实验室中常用的接种工具，掌握无菌操作和接种技术。

内容：1.土壤悬液稀释。

2.倒平板。 

3.计数菌落数并计算土壤样品中各种微生物数量

4.观察菌落特征。

5.挑取菌落接种于斜面。

二、基本原理

（一）从土壤中分离微生物

土壤中含有各种不同种类的微生物，为了研究某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来。分离微生物常用稀释倒平板法，根据要分离的微生物的营养、酸碱度等要求，选用适宜的培养基，使稀释后的微生物在固体培养基上形成单独菌落，从而获得某一菌株的纯培养。

（二）平板菌落计数法测定微生物数量

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。

（三）接种工具和接种技术

1.常用接种工具 

（1）接种环 

接种环是用金属丝做成的。使用前后均应在火焰上彻底灼烧灭菌，灭菌时右手持接种环（或接种针）之木柄，将铂丝直立于火焰中，渐渐下移使铂丝烧红，并将铂丝和木柄之间的金属捧也通过火焰数次。取菌时，必须待接种环（针）冷却后方可使用。  

（2）接种针 

灭菌处理基本上同接种环。 

（3）吸管 

微生物学实验一般使用刻度到底的吸管，须进行无菌操作时，事先塞少许棉花于吸管上端管口内，然后把吸管置于金属筒中或用纸条缠包起来，干热灭菌后方可使用。 

（4）微量移液器 

可调微量移液器主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的头（tip）。按动按钮，使弹簧上下活动，可在10～1000μl之间定量吸放液体。头可一次性使用，方便省事。 

2.各种培养基的接种方法 

培养物往新的培养基上移植，叫做接种。根据目的不同可分别采用接种环、接种针、移液管等进行斜面接种、液体接种、半固体穿刺接种和琼脂平板划线分离等。 

“无菌”是保证微生物实验室工作成功的前提条件，要做到这一点就得使用无菌的材料、器皿和采用无菌操作技术。无菌操作技术主要是防止外界环境微生物污染实验材料、破坏实验微生物的纯培养状态，同时也要防止实验材料污染环境或感染人体。因而要求：① 工作环境需进行消毒处理； ② 接种工具必须严格无菌。 

三、器材

1.仪器或其他用具：无菌平皿  99mL无菌水（带玻璃珠）2瓶  含9mL无菌水的试管6支 移液  无菌头

2.培养基：已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号、

3.土壤样品

四、操作步骤

（一）采集土样和土样处理

1. 取表层以下5～10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存，并做好标记，表明采样日期、地点等。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。

2. 将土样中的砂粒,石块,杂草等杂物清理干净，并将土样粉碎、过筛 。

（二）土壤稀释液的制备及混合倒平板

1.称取土样1g，迅速倒入含有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10～15min，使土样充分打散，静止10min，即成为10-2的土壤悬液。

2.吸取上清液1mL至9mL无菌水中，用头反复吹吸几次使混合均匀，即得10-3稀释液。如此重复，可依次制成10-3～10-7的稀释液。

3.按照下表吸取适当稀释度的稀释液1mL，分别加入到做好标记的无菌平皿中，并倒入相对应的事先融化并冷却至50～60℃左右的培养基（培养基加入量以能覆盖平皿底面为宜），立即将平皿在实验台面上以左旋三圈、右旋三圈的方法使稀释液与培养基混合均匀，待凝固。

4.将混合倒好的平板倒置于30℃培养箱培养。

5.下次做实验时计数并挑取单菌落接入斜面。

五、结果与分析

1.计数

每克土样中含细菌、放线菌、真菌的数量

菌数个/g干土=（任取一稀释度）同一稀释度平均每皿菌落数×稀释倍数×水分系数

  水分系数=100/（100-土壤中含水百分数），在这里可取1.47

2.分析土壤中各类微生物（细菌、放线菌、真菌）的优势种群。

六、思考题

1.若希望从土壤中分离出好气固氮菌，请写出分离培养的方法步骤。

2.写出平板计数法计数微生物细胞的原理。

实验八    多管发酵法检测水中大肠菌群

一、实验目的和内容

目的：1.掌握多管发酵法检测微生物数量的原理和方法。

2.熟悉大肠菌群生化反应中培养基的设计和用途。

内容：1.接种水样及其稀释液于发酵管。

2.培养，观察，记录结果。

二、基本原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。 

三、器材

1.仪器或其他用具：发酵用试管  杜氏小管  移液器  接种环  酒精灯 标签纸或记号笔

2.培养基:3倍浓乳糖蛋白胨培养基 乳糖蛋白胨培养基

四、操作步骤

（一）水样的采集

1.自来水  将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水5min，以排除水管内的积存水，随后用已灭菌的三角瓶或试管接取水样，以供检测。

2.池水、河水或湖水  将无菌的带玻塞的小口瓶浸入局水面10~15cm深的水层，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。

（二）多管发酵法检测大肠菌群

1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入按1:10稀释的水样1mL（即相当于原水样0.1mL），均贴好标签。各管摇匀后置于37℃恒温箱培养。

若待测水样污染严重，可按上述3种梯度将水样稀释10倍（即分别接种水样1mL、0.1mL、0.01mL），甚至100倍（即分别接种水样0.1mL、0.01mL、0.001mL），以提高检测的准确度。此时，不必用3倍浓乳糖蛋白胨培养基，全用乳糖蛋白胨培养基。

2.取出培养后的发酵管，观察管内发酵液颜色变为黄色者记录为产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。产酸产气者提示试管内有大肠菌群菌的存在，记录为阳性管。

3.根据3个梯度（10mL、1mL、0.1mL）的5支管中出现的阳性管数（即为数量指标），查附注中“15管发酵法水中大肠菌群5次重复测数统计表（表8-1）”的细菌最可能数，再乘以100 即换算成1L水样中的总大肠菌群数。

五、结果与分析

1.根据实验数据查表8-1。

2.多管发酵法检测数据及结果

1.检查饮用水中的大肠菌群有何意义？

2.试比较平板菌落计数法与多管发酵法检测微生物数量的特点与适用范围。

附注：

表8—1  15管发酵法水中大肠菌群5次重复测数统计表

实验九    微生物显微直接计数

一、实验目的和内容

目的：1.学习用计数板显微直接计数微生物数量的原理。

2.掌握用计数板显微直接计数微生物数量的方法。

内容：1.显微镜下观察计数板上的计数室。

2.计数板直接镜检计数。。

二、基本原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液或孢子悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积一定（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数室（图9-1），计数室的规格有两种：一种是型，称为麦氏血细胞计数板，共有16个中方格（中方格用双线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是25×16型，称为希里格式血细胞计数板，共有25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数室都由400个小方格组成。

计数室边长为1mm，则计数室的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。中间平台比两边的平台低0.1mm，故盖上盖玻片后，计数室的高度为0.1mm，所以每个计数室的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定若干中方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。

以25×16型为例进行计算：设5个中方格中的总菌数为A，则每个小格中细胞平均数N=A/（5×16）

已知：1mL=1 000mm3，计数室容积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，所以：1mL体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。

因此：每mL菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）==A/（5×16）×4×106×菌液稀释倍数（d）= A ×5×104×菌液稀释倍数（d）。

图9-1  25×16型血球计数板

同理，对于16×25型计数板一般计数4个中方格内的菌数，设4个中方格中的总菌数为A，则每个小格中细胞平均数N=A/（4×25）。

每mL菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）==A/（4×25）×4×106×菌液稀释倍数（d）=A×4×104×菌液稀释倍数（d）。

三、器材

1.仪器或其他用具：显微镜 血细胞计数板 手动计数器 酒精灯 无菌吸管 滤纸条 载玻片  盖玻片  无菌微量移液管 接种环  无菌试管  记号笔

2.试剂与培养基:牛肉膏蛋白胨培养基  美兰染色液  香柏油  二甲苯 分装4.5mL无菌水的试管6支

3.菌种:接种18小时的酵母培养液

四、操作步骤

1.血细胞计数板

1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。

2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。

5．计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小格）的菌数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数l个中方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N）或5个中方格的总菌数A，按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

五、结果与分析

将实验结果填入下表中：

 计数

1.根据你的体会，血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何减少误差？

2.根据你的实验结果，请分析一下平板菌落计数法与显微镜直接计数法的优劣。

实验十    微生物细胞大小的测量

一、实验目的和内容

目的：1.学习测微尺的使用和计算方法。

2.掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法。

内容：1. 在低倍镜、高倍镜、油镜下用镜台测微尺标定目镜测微尺每格长度。

2.测定大肠杆菌和酵母菌菌体的大小。

二、基本原理

微生物大小的描述是个体特征的重要数据。微生物个体微小，其大小的测定要在显微镜下借助测微尺来进行。测微尺由镜台测微尺和目镜测微尺组成。镜台测微尺是一个在其刻有精确等分线的载玻片（图10-1-1）。一般将1mm的直线等分成100小格，每格长0.01mm，即10μm。目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上等分50份（图10-1-2）。测量前先用镜台测微尺校正目镜测微尺每格所代表的长度，然后用目镜测微尺直接测量微生物细胞的大小。

三、器材

1.仪器或其他用具：显微镜 测微尺  载玻片  盖玻片  镜头纸 香柏油  二甲苯等 

2.菌种:大肠杆菌  酵母菌 

四、操作步骤

1.放置目镜测微尺

取出目镜，旋开接目透镜，将目镜测微尺放在目镜的镜筒内的隔板上（有刻度一面向下），然后旋上接目透镜，将目镜放回显微镜镜筒。

2.目镜测微尺的标定

将镜台测微尺放置于置物台上，有刻度面向上。先用低倍镜观察，调节焦距，看清镜台测微尺的刻度。转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，并使两尺最左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺刻度重合的刻度线。然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺的格数（图10-1-3）。同样的方法，转换为高倍物镜和油镜，可以分别测出高倍镜下和油镜下两重合线间目镜测微尺与镜台测微尺所占的格数。

3.计算方法

例如，如图10-1-3中所示，则此时

                   图10-1   显微测微尺及其校正

4.菌体大小的测定

将镜台测微尺取下，分别换上酵母和大肠杆菌的干涂片，先在低倍镜找到目标物，然后在高倍镜和油镜下用目尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占据目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格所代表的实际长度计算出菌体的长和宽。将结果详细记录于“菌体大小测定结果”的表格中。

例如，目镜测微尺在这台显微镜下，每格相当于1.5μm，测量的结果，若菌体的平均长度相当于目镜测微尺的2格，则菌体长应为2×1.5μm=3.0μm。

一般测量菌体的大小，应测定10~20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。

5、实验结果与分析

1.目镜测微尺标定结果

1.为什么在更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定？

2.若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际宽度（或长度）是否相同？为什么？

实验十一    紫外线照射杀菌实验

一、实验目的和内容

目的：1.掌握紫外线杀菌的原理。

2.掌握杀菌曲线制作方法。

内容：1.以紫外线对细菌进行不同照射时间的处理。

2.处理后的菌液涂布平板。

3.培养，观察，纪录结果。

二、基本原理

波长为200—300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2），O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1．2m为宜。

三、器材

1.仪器或其他用具：紫外灯 磁力搅拌器和搅拌子  无菌平皿  酒精灯  三角瓶 玻璃珠  移液器  无菌头  涂布棒

2.培养基: 酵母培养基

3.菌种:酵母

四、操作步骤

（一）菌悬液的制备

1.称取适量干酵母粉（约0.2g）或过夜震荡培养的酵母培养液1mL，置于含有100mL无菌水及玻珠的三角瓶中，震荡10～20min后，从中取10mL至另一含100mL无菌水的三角瓶中，震荡均匀（含菌数约为107个/mL），即得稀释至10-4的菌液。

2.将1中得到的菌液继续进行梯度稀释，得到10-5、10-6、10-7、10-8的稀释液。

（二）平板倒制

融化酵母培养基，等冷至50～60℃时倒制平板，备用。

（三）紫外线照射与涂布平板

1.取一个无菌的培养皿，置于超净工作台内，打开皿盖，紫外线照射约20min。关闭紫外线灯，合上皿盖。

2.取10mL10-4的菌液加到以上经紫外线照射的空皿内，将培养皿置于磁力搅拌器的中间，加入经75%乙醇浸泡的磁力搅拌子，打开磁力搅拌，调整转速至适当。

3.打开紫外灯，照射20S后关闭紫外灯（照射时培养皿的盖子是打开的）。吸取0.1mL菌液至做好标记的对应的平板中。

4.打开紫外灯，照射10S后关闭紫外灯，即得照射时间为30S菌液。吸取0.1mL菌液至做好标记的对应的平板中。

5.重复4，可得照射时间为40S及50S的菌液，分别吸取0.1mL菌液至做好标记的对应的平板中。

6.关闭磁力搅拌器。将以上加了照射菌液的平板涂布均匀。

7.吸取（一）中10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的稀释液各0.1mL菌液至做好标记的对应的平板中，涂布均匀，用于照射前菌体数量的计数。

（四）培养，计菌落数

将涂布好的平板倒置，32℃培养约24～48h后计菌落数。

五、实验结果与分析

1.记录计数结果，计算死亡率或存活率

UV照射时间t

6、思考题

1.紫外线照射时，为什么照射液不能太深？同时要对照射液用磁力搅拌器进行搅拌？

2. 紫外线杀菌的原理是什么？紫外线杀菌效率与什么因素成正比。

实验十二   呼吸缺陷型酵母筛选

一、实验目的和内容

目的：1.学习用TTC平板筛选呼吸缺陷型酵母的原理。

2.了解紫外线对微生物的诱变效应。

3.掌握点种技术。

内容：1.将经过紫外线处理生长出来的菌落点种与TTC平板上。

2.培养，观察，纪录结果，计算突变率。

3.将突变株接种于斜面，培养。

二、基本原理

突变可以自发产生，也可以诱变发生，诱发突变的因素一般分为化学因素和物理因素，其中紫外线是一种常用的有诱变作用的物理因素。它主要能使DNA链中两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体而影响DNA正常复制，从而造成基因突变。

呼吸缺陷型酵母是一类酵母线粒体DNA发生突变的菌株，酵母线粒体膜上组成呼吸链的细胞色素c,a,b等蛋白质的基因缺失，导致线粒体膜结构不完整从而导致酵母的呼吸功能丧失。线粒体基因组缺失后的突变还导致菌体氧化磷酸化功能缺失，从而使其糖酵解酶系和醇脱氢酶系的活性大大提高，其酒精发酵能力可能大大高于野生型菌株。

TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)能够竞争呼吸链中的还原氢[H]后生成红色TP，可以快速筛选呼吸缺陷型酵母突变株。

三、器材

1.仪器或其他用具：灭菌牙签  酒精灯  无菌平皿  试管（斜面）

2.培养基:含TTC的酵母培养基

3.菌种:酵母

四、操作步骤

1.倒TTC平板凝固后备用。

2.取经紫外线诱变的酵母菌在TTC平板上点菌，培养40~48h。记录所点菌落对应的紫外线照射时间。

3.挑取TTC平板上的白色菌落转入试管培养，以备后用。

五、实验结果与分析

1.紫外线诱变的原理。

2.呼吸缺陷型酵母的酒精发酵能力为什么可能比野生型酵母强？

3.用TTC平板筛选呼吸缺陷型酵母的原理是什么？

4.点种菌落时有何要注意的地方？ 

综合实验    乳酸菌的分离筛选与乳酸饮料

一、实验目的和内容

目的：巩固获得微生物纯培养的方法，学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料地方法，了解乳酸菌的生长特性

内容：1.从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化。

2.乳酸发酵及检测。

3.乳酸菌饮料制作。

4.自制乳酸质量品尝。

二、实验原理

许多种类的微生物（主要是细菌）在厌氧条件下分解己糖产生乳酸的作用称为乳酸发酵。能利用可发酵糖产生乳糖的细菌称为乳酸细菌。乳酸细菌多是兼性厌氧菌，在厌氧条件下经过EMP途径，发酵己糖进行乳酸发酵。常见的乳酸细菌有链球菌属（Streptococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和明串珠菌属（Leuconostoc）等。酸乳是一种常见的乳酸饮料，是以牛乳为主要原料，加入一定量的糖类，接入一定量乳酸菌，经过发酵后而制成的饮料。

三、实验材料

1.菌种：嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus casei)，乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。

2.培养基：BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管（见注）、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙。

3.仪器及用具：恒温水浴锅、酸度计、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶、培养皿、试管、三角瓶。

四、操作步骤

（一）乳酸菌的分离纯化

1.分离  取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5，取其中的10-4、10-5两个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

2.鉴别  选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4~6次，最终选出能在3~6h凝固的牛乳管，做菌种待用。

（二）乳酸发酵及检测

1.发酵  在无菌操作下将分离的一株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，40~42℃静止培养。

2.检测  为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6~8小时取样分析，测定pH。另一组在接种培养24小时后每瓶加入CaCO33g（以防止发酵液过酸使菌种死亡），每6~8h 取样，测定乳酸含量（方法见注），记录测定结果。

（三）乳酸菌饮料的制作

1.将脱脂乳和水以1:7~10的比例，同时加入5%~6%蔗糖，充分混合，于80~85℃灭菌10~15min，然后冷却至35~40℃，作为制作饮料的培养基质。

2.将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%~5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分撞到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液分装3~5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

3.将接种后的酸乳瓶置于40~42℃恒温箱中培养3~4h。培养时注意观察，在出现凝乳后结束培养。然后转入4~5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中（pH4~4.5），凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

4.以品尝为标准评定酸乳质量  采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。比较项目见表13-1。

5、实验结果与分析

1.将分离得到的乳酸菌基本情况记录于表13-1中。

表13-1     分离得到的乳酸菌基本情况

          序次

表13-3   乳酸发酵的检测结果

表13-2    自制酸乳品评结果

1.发酵酸乳为什么能引起凝乳？

2.为什么采用乳酸菌混合发酵比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳？

注：

（一）脱脂乳试管

直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。

（二）培养基：

1、BCG牛乳培养基：

（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500 mL，琼脂20g，pH6.8，121℃灭菌20min。

以无菌操作趁热将（A）（B）溶液混合均匀后倒平板。

2、乳酸菌培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，NaCl5g，水1000mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

（三）乳酸检测方法    滴定法

1. 方法原理

供试品加水溶解后，加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（约0.1mol/L，具体浓度需标定）滴定，直至溶液呈微红色，保持30s不褪色，即为终点，读出滴定液使用量，并将滴定的结果用空白试验校正，计算乳酸含量。

2. 试剂

（1） 水（新沸放置至室温）

（2） 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）

（3） 酚酞指示液

（4） 乙醇

(5）基准邻苯二甲酸氢钾

3. 试剂制备

（1） 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）

配制：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加新沸过的冷水使成1000mL。

标定：减量法准确称取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.4～0.6g三份，分别置于250mL锥形瓶中，各加新沸过的20～30mL蒸馏水振摇，使其溶解；加酚酞指示液1~2滴，用本液滴定，边滴定边摇动锥形瓶，直至溶液呈微红色，保持30s不褪色，即为终点，记下读数。每1mL氢氧化钠滴定液（1mol/L）相当于204.2mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。

计算：

氢氧化钠滴定液浓度（mol/L）

= 

 ()

贮藏：置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔，孔内各插入玻璃管1支，1管与钠石灰管相连，1管供吸出本液使用。

（2）酚酞指示液

取酚酞0.5g，溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，并加入20mL水，然后再加入氢氧化钠溶液，直至加入一滴立即变成粉红色，再加入水定容至加100mL。

4.样品测定操作步骤

精密量取样品   mL（或精密称取供试品1g），精密加水50mL，加酚酞指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，直至溶液呈微红色，保持30s不褪色，即为终点，读出滴定液使用量V1，并将滴定的结果用空白试验（滴定液用量Vck）校正，计算乳酸含量。每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于90.08mg乳酸（C3H6O3）。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

计算：

5.标定NaOH溶液

   实验步骤

　减量法准确称取经干燥的KHC8H4O40.4～0.6g三份(详见实验：天平称量方法练习)，分别置于250mL锥形瓶中，各加20～30mL蒸馏水溶解，加入1～2滴酚酞指示剂，用欲标定的NaOH溶液滴定,边滴定边摇动锥形瓶，直至溶液呈微红色，保持30s不褪色，即为终点，记下读数。根据KHC6H4O4的重量和消耗NaOH溶液的体积，计算NaOH溶液的浓度，要求三次测定的相对误差≤0.2％。

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例如：

              序次

1.标定NaOH常用基准物质是邻苯二甲酸氢钾、草酸。

邻苯二甲酸氢钾，易纯制，无结晶水，在空气中不吸湿，容易保存，摩尔质量大，是一种较好的基准物质。 

将KHC6H4O4分析纯固体在100～125OC干燥。温度超过此范围时，则脱水变为邻苯二甲酸酐，引起误差。

2.由于反应产物是邻苯二甲酸钾钠盐，在水溶液中显碱性。（即计量点时溶液显微碱性），可选用酚酞作指示剂。