全血分离获得血清的方法及步骤(精)

材料与方法

1.1 血清采集 MG 患者全血来自 2004~2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。 根据典型临床表现、 新斯的明试验、 低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊, 无其他自身免 疫性疾病,未经其他免疫抑制治疗,并参照 1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾 肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。 -70 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂 固相 pH 梯度干胶条 IPG strip (Amersham 公司产品, 非线性 pH 3~10, 7 cm 。 3-〔 3-(胆酰胺基丙基 二甲氨基〕 丙磺酸盐 {3-〔 (3-cholamidopropyl dimethylamino 〕 -1-propanesul-fonate , CHAPS }, 二硫苏糖醇 (DL-dithiothreitol , DTT , 三丁基膦 (tributyl phosphine , TBP , 尿素, 硫脲, 碘乙酰胺 (iodoacetamide , IAA , 丙烯酰胺 (acrylamide 、 甲 双 丙 烯 酰 胺 (N , N'-methylenebi-sacrylamide , 四 甲 基 乙 二 胺 (N , N , N , N-tetram-ethyl-ethylenediamine , TEMED ,过硫酰胺(am-monium persulfate , APS ,三 羟甲基氨基甲烷〔 tris (hydroxymethyl aminomethane 〕 、甘氨酸(glycine , Gly 和十二 烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS 均为 Bio-Rad 公司产品。琼脂糖为华美生物公 司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用 MilliQ 水配制。

1.3 主要仪器 高速冷冻离心机,德国 Eppendorf 公司产品 ;EttanTMIPGphor Ⅱ, Amersham Biosci-ences 公司产品 ;P-2000分光光度仪, Hitachi 公司产品 ;SE-600电泳仪, Amersham 公 司产品 ; 纯水装置, Millipore 公司产品 ;GS-710光密度扫描仪, Bio-Rad 公司产品 ; 冷却水循环 系统, Cole-Parmer 公司产品 ;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer, 美 国 Bruker-Daltonics 公司产品 ;LCQ Deca XP Plus,美国 Thermo Finnigan公司产品。

1.4 双向电泳

1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清 -70 ℃反复冻融 4次后,用 Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用 Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐,冻干回收的 样品, -70 ℃保存。用裂解液(9 mol/L 尿素、 4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和 cocktail 酶 抑制剂进行复溶,并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

1.4.2 等电聚焦 自 -20 ℃取出的胶条,室温下平衡 10 min ,以 500 μg上样量在每份样本中 加入上样缓冲液 (8 mol/L尿素、 2% CHAPS、 1% Bio-lyte和 1% TBP 以及标准蛋白质分子, 上样于泡胀槽中,加入矿物油覆盖。程序设置如下 :30 V 12 h, 500 V 1 h, 1 000 V 1 h, 8 000 V 6 h。 恒温 20 ℃。 等电聚焦电泳后 IPG 胶条在平衡液 1(Tris-base 50 mol/L 、 尿素 6 mol/L、 甘油 30%、 SDS 2%、溴酚蓝 0.002%和 DTT 100 mg中于振荡器上振荡 15 min; 然后置入 平衡液 2(成分同平衡液 1,用 400 mg 碘乙酰胺代替 100 mg DTT 同样于振荡器上振荡 15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直电泳 采用 12.5%的均匀 SDS2聚丙烯酰胺凝胶(水 23.2 ml, 30%丙烯 酰胺溶液 32.46 ml, 1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 8.8 20 ml, 10% SDS 0.8 ml, 10% APS 0.4 ml, TEMED 3.76 μl,胶总体积 80 ml 。将平衡后的 IPG 胶条移至凝胶的上方,胶条一端放入低 分子量蛋白质标准, 0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液(Tris 5 mmol/L, Gly 192

mmol/L和 SDS 0.1% 。 初始电流为每块胶 40 mA, 电泳 20 min, 然后以每块胶 60 mA电流, 直至溴酚蓝前沿。

1.4.4 银染色 电泳结束后, 采用银染色法, 通过固定, 银染色, 显影, 停显及脱色, 至背景清晰。

1.5 图像分析 每个样品常规进行 3次二维电泳, 用 GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分 别进行扫描, 所得扫描图像输入计算机, 采用 Image-master 软件对图像进行背景消减、 蛋白 质点检测和校正, 获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。 选取 Ratio ≥1.5的蛋白质点认 为有差异。所有数据的统计分析均采用 SPSS 12.0软件,统计学分析采用 t 检验。

1.6 基质辅助激光解吸电离 -飞行时间质谱分析 用手术刀片切下胶上目标条带,进行切胶、 胶上胰蛋白酶酶解 20 h ,抽提酶解肽段, Zip Tip脱盐后点样,行基质辅助激光解吸电离 -飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry , MALDI-TOF-MS 分析(飞行管长 2.7 m,加速电压 20 kV ,反射电压 23 kV 。将第 1级 质谱得到的肽片段质量指纹图谱、 肽质量指纹图谱与第 2级质谱得到的肽序列信息一起用来 检索蛋白质数据库,找出匹配的蛋白质。

1.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting, PMF 数据 于 Bio-Works (Thermo Finnigan, San Jose, CA 软件搜索相应的库。搜索使用的数据库 为 IPI human 蛋白库(SEQUEST 结果过滤参数为 :当 Charge+1, Xcorr≥1.9; 当 Charge+2, Xcorr≥2.2; 当 Charge+3, Xcorr≥3.75; 其中 DelCN≥0.1以及 NCBI 上 Homo sapiens的非冗余 蛋白库 (redundant data-base 。 检索参数为胰蛋白酶解 ; 氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨 酸 ; 模式为单同位素峰 ; 肽片断最大误差控制在 100 ppm; 肽片断最大分子量误差为 ±0.5 Da; 每 个肽允许有 1个不完全裂解位点。

2 结果

2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱 的建立及分析 经 2-DE 技术及银染色后, 得到了两组血清的双向凝胶电泳图, 并于相同的条件下重复实验 3次。 在正常对照组细胞蛋 白质组双向电泳图谱上可观察到 1 463±179个蛋白点,而脾肾虚型重症肌无力组可见到 1 508±个蛋白点