肉制品检验作业指导书

一、依据： GB 47.2—2010

二、目的：食品中菌落总数的测定

三、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1  恒温培养箱：（36 ±1） ℃

2   恒温水浴箱：（46 ±1）℃。

3  天平：感量为 0.1 g、振荡器。

4  无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

5  无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL、无菌培养皿：直径 90 mm。

6  pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

7  放大镜或/和菌落计数器。

四、 培养基和试剂

1  平板计数琼脂培养基

2  磷酸盐缓冲液

3  无菌生理盐水

五、检验步骤

1   称取 25 g 样品置盛有 225 mL 生理盐水的无菌捣碎机杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。

2  用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。

3   按 5.2操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。

4  根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5  及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基 （46 ±1）℃倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

6  待琼脂凝固后，将平板翻转，（36±1）℃培养 48 h±2 h。

六、菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

七、结果与报告

1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。

2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算：

N= ∑C/ (n1+n2)d

3  菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

4 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

5  若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

6  若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

7  称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。

大肠菌群计数（平板计数法）

一、依据： GB 47.3—2010

二、目的：食品中大肠菌群的计数

三、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：（36±1） ℃。

3.2 恒温水浴箱：（46±1） ℃。

3.3 天平：感量 0.1 g、振荡器

3.4 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

3.5 无菌锥形瓶：容量 500 mL、无菌培养皿：直径 90 mm。

3.6  pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。

3.7 菌落计数器。

四、 培养基和试剂

4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤

4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤

4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）

4.4 磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水

4.5无菌 1 mol/L氢氧化钠（ NaOH）、无菌 1 mol/L氯化氢（ HCl）。

五、检验步骤

5.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,

8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,制成 1:10 的样品匀液。

5.1.2 样品匀液的 pH 值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。

5.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液

或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌

吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。

5.1.4 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释

1 次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。

六、 平板计数

6.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐

水加入无菌平皿作空白对照。

6.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心

旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平

板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

6.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在 15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。

6.4 证实试验

从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃

培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

6.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g

（mL）样品中大肠菌群数。例：10 -4 样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10 4 /g （mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。

食品中蛋白质的测定（分光光度法）

一、依据： GB 5009.5—2010

二、目的：食品中蛋白质的测定

三、设备和材料

1设备：

1.1 分光光度计。

1.2 电热恒温水浴锅：（100 ± 0.5） ℃。

1.3 10 mL 具塞玻璃比色管。

1.4 天平：感量为 1mg。

2 试剂：

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的三级水。

2.1 硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）、硫酸钾（K 2 SO 4 ）、硫酸（H 2 SO 4 密度为 1.84 g/L）、氢氧化钠（NaOH）、

对硝基苯酚（C 6 H 5 NO 3 ）、乙酸钠（CH 3 COONa·3H 2 O）、无水乙酸钠（CH 3 COONa）、

乙酸（CH 3 COOH）、37%甲醛（HCHO）、乙酰丙酮（C 5 H 8 O 2 ）

2.2溶液：

2.2.1 氢氧化钠溶液（300 g/L）：称取 30 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至 100 mL。

2.2.2 对硝基苯酚指示剂溶液（1 g/L）：称取 0.1 g 对硝基苯酚指示剂溶于 20 mL 95%乙醇中，加水稀

释至 100 mL。

2.2.3 乙酸溶液（1 mol/L）：量取 5.8 mL 乙酸（10.8），加水稀释至 100 mL。

2.2.4乙酸钠溶液（1 mol/L）：称取 41 g 无水乙酸钠（10.7）或 68 g 乙酸钠（10.6），加水溶解后并

稀释至 500 mL。

2.2.5 乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取 60 mL 乙酸钠溶液（10.14）与 40 mL 乙酸溶液（10.13）混合，该

溶液 pH 4.8。

2.2.6 显色剂：15 mL 甲醛（10.9）与 7.8 mL 乙酰丙酮（10.10）混合，加水稀释至 100 mL，剧烈振

摇混匀（室温下放置稳定 3d）。

2.2.7 氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0 g/L）：称取 105 ℃干燥 2 h 的硫酸铵 0.4720 g 加水溶解后

移于 100 mL 容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于 1.0 mg 氮。

2.2.8 氨氮标准使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取 10.00 mL 氨氮标准储备液（10.17）于 100ml 容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于 0.1mg 氮。

四、分析步骤

4.1 试样消解

称取经粉碎混匀的固体试样 0.1 g～0.5 g（精确至 0.001 g），移入干燥的 100 mL 或 250 mL 定氮瓶中，加入 0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及 5 mL 硫酸（10.3），摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以 45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入 20 mL 水，放冷后移入 50 mL 或 100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。

4.2 试样溶液的制备

吸取 2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于 50 mL 或 100 mL 容量瓶内，加 1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液（10.12），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（10.11）中和至黄色，再滴加乙酸溶液（10.13）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

4.3 标准曲线的绘制

吸取 0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和 1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于 0.00 µg、5.00 µg、10.0 µg 、20.0 µg、40.0 µg、60.0 µg、80.0 µg 和 100.0 µg 氮），分别置于 10 mL 比色管中。加 4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液（10.15）及 4.0 mL 显色剂（10.16），加水稀释至刻度，混匀。置于 100 ℃水浴中加热 15 min。取出用水冷却至室温后，移入 1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长 400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。

4.4试样测定

吸取 0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于 10 mL 比

色管中。以下按 12.3 自“加 4 mL 乙酸钠-乙酸缓酸溶液（pH 4.8）及 4 mL 显色剂……”起操作。试样

吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。

4.5分析结果的表述

试样中蛋白质的含量按公式进行计算：

X={(c-c0)/m×(v2/v1) ×(v3/v4) ×1000×1000}×1000F错误！未指定书签。

式中：

X ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g）；

c ——试样测定液中氮的含量，单位为微克（µg）；

c 0 ——试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（µg）；

V 1 ——试样消化液定容体积，单位为毫升（mL）；

V 2 ——制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（mL）；

V 3 ——试样溶液总体积，单位为毫升（mL）；

V 4 ——测定用试样溶液体积，单位为毫升（mL）；

m ——试样质量，单位为克（g）；

F ——氮换算为蛋白质的系数。肉与肉制品为 6.25

食品中水分的测定（直接干燥法）

一、依据： GB 5009.3—2010

二、目的：食品中水分的测定

三、设备

3.1 扁形铝制或玻璃制称量瓶

3.2 电热恒温干燥箱

3.3 干燥器（内附有效干燥剂）

3.4 天平：感量为0.1mg

四、试剂和材料

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯

4.1 盐酸：优级纯。

4.2 氢氧化钠（NaOH）：优级纯。

4.3 盐酸溶液（6mol/L）：量取50ml盐酸，加水稀释至100ml。

4.4 氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取24g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。

5、分析步骤

5.1 取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于101℃~105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热1h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。

5.2 将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm，不易研磨的样品应尽可能切碎，称取2g~10g试样（精确至0.0001g），放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm，如为疏松试样，厚度不超过10mm，加盖，精密称量后，置101℃~105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h~4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。

5.3 然后再放入101℃~105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放入干燥器内冷却0.5h后再称量。

5.4 重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。

  注：两次恒重值在最后计算中，取最后一次的称量值。

六、分析结果的表述

  试样中的水分的含量按下式进行计算。

                      X=

  式中：

  X——试样中水分的含量，单位为克每百克（g/100g）；

  m1——称量瓶和试样的质量，单位为克（g）；

  m2——称量瓶和试样干燥后的质量，单位为克（g）；

  m3——称量瓶的质量，单位为克（g）；

  水分含量≥1g/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

7、精密度

  在重复性条件下获得的两次测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的5%。

食品中氯化钠的测定（间接沉淀滴定法）

一、依据： GB/T 12457-2008

二、目的：食品中氯化钠的测定

三、仪器和设备

3.1 组织捣碎机。

3.2 粉碎机。

3.3 研钵。

3.4 振荡器。

3.5 水浴锅。

3.6 分析天平：感量0.0001g。

四、试剂和溶液

  除非另有规定，所有试剂均使用分析纯试剂；分析用水应符合GB/T 6682规定的二级水的规格。

4.1  冰乙酸。

4.2  蛋白质沉淀剂。

4.2.1  沉淀剂：称取106g亚铁，溶于水中，转移到1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

4.2.2  沉淀剂：称取220g乙酸锌，溶于水中，加入30mL冰乙酸，转移到1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

4.3  溶液（1:3）：1体积浓与3体积水混匀。使用前应煮沸、冷却。

4.4  乙醇溶液（80%）：80mL95%乙醇与15mL水混匀。

4.5  0.1mol/L银标准滴定溶液的配制：称取17g银，溶于水中，转移到1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，置于避光处。

4.6  0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的配制：称取9.7g硫氰酸钾，溶于水中，转移到1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

4.7  硫酸铁铵饱和溶液：称取50g硫酸铁铵，溶于100mL水中，如有沉淀应过滤。

4.8  0.1mol/L银标准滴定溶液和0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的标定：

4.8.1  氯化物的沉淀：称取0.10g~0.15g基准试剂氯化钠（或经500℃~600℃灼烧至恒重的分析纯氯化钠），0.0002g，于100mL烧杯中，用水溶解，转移到100mL容量瓶中。加入5mL溶液，边剧烈摇动边加入30.00mL（V1）0.1mol/L银标准滴定溶液，用水稀释至刻度，摇匀。在避光处放置5min，用快速滤纸过滤，弃去最初滤液10mL。

4.8.2  过量银的滴定：取上述滤液50.00mL于250mL锥形瓶中，加入2mL硫酸铁铵饱和溶液，边剧烈摇动边用0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液滴定至出现淡棕红色，保持1min不褪色。记录小号硫氰酸钾标准滴定溶液的体积的数值（V2）。

4.8.3  银标准滴定溶液与硫氰酸钾标准滴定溶液体积比的确定：取0.1mol/L银标准滴定溶液20.00mL（V3）于250mL锥形瓶中，加入30mL水，5mL溶液和2mL硫酸铁铵饱和溶液，一下按4.8.2步骤操作，记录小号0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的体积的数值（V4）。

4.8.4  银标准滴定溶液浓度和硫氰酸钾标准滴定溶液浓度的计算：

  按式1、式2、式3分别计算银标准滴定溶液浓度的准确的数值（c1）和硫氰酸钾标准滴定溶液浓度的准确的数值（c2）。

                   式1：    F=

  式中：

     F——银标准滴定溶液与硫氰酸钾标准滴定溶液的体积比；

     V3——确定体积比（F）时，银标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）；

     V4——确定体积比（F）时，硫氰酸钾标准滴定溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；

     c1——硫氰酸钾标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

     c2——银标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）。

                  式2：    

  式中：

     c2——银标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

     m0——氯化钠的质量的数值，单位为克（g）；

     V1——沉淀氯化物时加入银标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）；

     V2——滴定过量银时小号硫氰酸钾标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）；

     F——银标准滴定溶液于硫氰酸钾标准弟弟的那个溶液的体积比；

0.05844——与1.00mL银标准滴定溶液[c（AgNO3）=1.000mol/L]相当的氯化钠的质量的数值，单位为

           克（g）。

                 式3：     c1=c2×F

  式中：

     c1——硫氰酸钾标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

     c2——银标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

     F——银标准滴定溶液与硫氰酸钾标准滴定溶液的体积比。

五、试样和试液的制备

5.1  试样的制备

5.1.1  块状或颗粒状样品

  取有代表性的样品至少200g，用粉碎机粉碎或用研钵研细，置于封闭的玻璃容器内。

5.1.2  固、液体样品

  取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，置于密闭的玻璃容器内。

5.2  试液的制备

  称取约20g试样，精确至0.001g，于250mL锥形瓶中。加入100mL70℃热水，煮沸15min，并不断摇动，冷却至室温，依次加入4mL沉淀液、4mL沉淀液.每次加入沉淀液充分摇匀。在室温静置30min。将锥形瓶中的内容物全部转移到200mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。用滤纸过滤，弃去最初滤液。

六、分析步骤

6.1  氯化物的沉淀

  取含有50mg~100mg氯化钠的试液，于100mL容量瓶中。加入5mL溶液。剧烈摇动时，准确滴加20.00mL~40.00mL0.1mol/L银标准滴定溶液，用水稀释至刻度，在避光处静置5min。用快速滤纸过滤，弃去10mL最初溶液。

  当加入0.1mol/L银标准滴定溶液后，如不出现氯化银凝聚沉淀，而呈现胶体溶液时，应在定容、摇匀后移入250mL锥形瓶中，置沸水浴中加热数分钟（不得用直接火加热），直至出现氯化银凝聚沉淀。取出，在冷水中迅速冷却至室温，用快速滤纸过滤，弃去10mL最初滤液。

6.2  滴定

  取50.00mL滤液于250mL锥形瓶中，加入2mL硫酸铁铵饱和溶液。边剧烈摇动边用0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液滴定至出现淡棕红色，保持1min不褪色。记录小号0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的毫升数（V5）。

6.3  空白试验

  用50mL水代替50.00mL溶液，准确加入沉淀试样氯化物时滴加0.1mol/L银标准滴定溶液体积的二分之一，以下按6.1和6.2步骤操作。记录小号0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的毫升数（V0）。

七、计算结果

  食品中氯化钠的含量以质量分数X1计，数值以%表示，按式4计算：

                     式4：       X1=

  式中：

  0.05844——与1.00mL银标准滴定溶液[c（AgNO3）=1.000mol/L]相当的氯化钠的质量的数值，单位

             为克（g）；

     c1——硫氰酸钾标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；

     V0——空白试验小号硫氰酸钾标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）；

     V5——滴定试样（6.2）时小号0.1mol/L硫氰酸钾标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）；

     K1——稀释倍数；

     m——试样的质量的数值，单位为克（g）。

  计算结果表示到小数点后两位。

八、允许差

  同一样品两次平行测定结果之差，每100g试样不得超过0.2g。