ELISA的操作

一、阻断ELISA

1、液相阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫O型、ASIAⅠ型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒：兰州兽医研究所生产）

1.1原理： ①兔抗口蹄疫血清+病毒抗原（被检血清与病毒抗原反应后病毒抗原剩余）+豚鼠抗口蹄疫血清+兔抗豚鼠酶标结合物+底物显色+终止液+读数（OD值，颜色越深OD值越大）。颜色的深浅与病毒抗原剩余量成正比，病毒抗原剩余多，则与之反应的被检血清的抗体效价低，反之，病毒抗原剩余少，则与之反应的被检血清的抗体效价高。因此，随着被检血清的递倍稀释，血清效价逐渐降低，与被检血清反应的病毒抗原剩余逐渐增多，颜色也逐渐加深。

②兔抗口蹄疫血清+被检血清（被检血清与病毒抗原反应后被检血清剩余），则反应终止，以后加入的试剂随着洗板被清洗，最终无颜色反应，则说明被检血清抗体效价高。因此，反应颜色越浅则抗体效价最高，颜色的深浅也抗体的效价成反比。

1.2 操作过程

1.2.1提前一天准备工作：

1稀释血清：使用血清稀释板（U型96孔板），常用稀释布局如下图：按图示加入相应量的PBST,吸取12.5ul被检血清和50ul阴、阳性血清于相应孔中，将待检血清和阴、阳性血清做2倍连续稀释，然后再加入50ul的病毒抗原对照，病毒抗原对照孔加入100ul病毒抗原对照，这时，除去空白孔，所有孔均为100ul体系。

96 孔 酶 标 板 20 份 检 测 样 品 布 局 图

用包被缓冲液稀释口蹄疫兔抗血清至工作浓度，将稀释后的口蹄疫兔抗血清加入ELISA板中，每孔加50ul,震荡后使包被液布满整个孔底，封板，在室温条件下过夜。

1.2.2 第二天工作（严格按说明书操作）

洗ELISA板→转移血清稀释板上的病毒抗原与血清反应液（按照稀释血清布局图的格式相应的转移至ELISA板上）→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的豚鼠抗血清→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的兔抗豚鼠酶结合物→孵育60分钟→洗ELISA板→加入底物（现加入相应量的H2O2）→孵育15分钟→加终止液→读数→结果判定。

1.3 结果判定

1.3.1试验成立条件

病毒抗原对照至少两个孔的OD值在1.0以上，一般在1.0-2.0范围内较好，阳性对照抗体滴度应是1：1024±1，阴性对照抗体滴度应小于1：4。

1.3.2临界值计算（参照说明书）

1.3.3结果判定（参照说明书）

1.4 注意事项

1.4.1 试剂回温，每次做实验之前，应将试剂恢复到室温至少半小时。

1.4.2 口蹄疫兔抗血清加入ELISA板后，要对ELISA板进行震荡，使得液体完全布满ELISA板孔底部。

1.4.3 稀释血清及以后ELISA反应过程中移液量及加样量一定要保证所有孔一致，避免移液过程及加样过程中液体量忽多忽少，这样就会导致OD值忽大忽小，呈现不了由上到下OD值由小到大的规律性变化，从而结果将无法判读。

1.4.4 加底物时，一定不要忘记加H2O2，并且每块板加底物的时间不要相差太大。

1.4.5 如果OD值数值没有规律可言，建议此份样品重做。

1.4.6 如果OD值数值完全倒置，呈现由大到小的变化，最好重新稀释，并且建议增加稀释梯度。

2.单抗阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒，北京世纪元亨生产）

2.1 原理

试剂盒已经在ELISA板上包被好了口蹄疫病毒非结构蛋白，如果待检血清中存在抗非结构蛋白的抗体，就会与包被抗原发生反应，从而阻断下一步酶标抗非结构蛋白抗体与包被抗原结合，如果待检血清中抗非结构蛋白的抗体越多，那酶标抗非结构蛋白抗体与包被抗原结合的就少，从而最终的颜色反应就浅，因此待检血清中抗非结构蛋白抗体的含量与颜色呈反比。

2.2 操作过程

在ELISA板上标记号阴、阳性对照位置及样品位置（可参照下图），每孔加入100ul阴阳性血清（不需要稀释）和待检血清（1：1稀释）+37℃孵育60分钟+洗板+酶结合物100ul+37℃孵育30分钟+洗板+底物+终止液+读数。

2.3.1试验成立条件

①阴性对照OD450平均值-阳性对照OD450平均值≥0.6

②阳性对照阻断率≥55%

2.3.2阻断率的计算

Inh%=(阴性对照OD450平均值-样品孔OD450值)/ 阴性对照OD450平均值*100%

2.3.3 结果判定

①猪血清样品

被检样品Inh%≥30%，判为阳性；被检样品20%≤Inh%≤30%，判为可疑；被检样品Inh%＜20%，判为阴性。

②牛羊及其他动物血清样品

被检样品Inh%≥40%，判为阳性；被检样品25%≤Inh%≤40%，判为可疑；被检样品Inh%＜25%，判为阴性。

2.4 注意事项

2.4.1 试剂盒应恢复至室温后再使用，至少在室温条件下放置30分钟。

2.4.2 待检血清最好在稀释板上稀释后再往ELISA板上转移

2.4.3洗涤时，各孔均需加满洗涤液，防止因洗涤不充分造成非特异性反应。

2.4.4 不同批次试剂不能混用。

二、间接ELISA

1.代表试剂盒 

LSI猪繁殖和呼吸综合征抗体检测试剂盒、口蹄疫非结构蛋白抗体检测（兰州兽医研究所生产）、IDEXX猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测盒

2.原理

ELISA板上事先包被好相应抗原，如果待检血清含有相应的抗体，就会与ELISA板上的抗原结合，再加入酶标抗抗体，酶标抗抗体与待检血清中的抗体结合，当加入底物时呈现颜色反应，当待检血清中抗体越多，结合的酶标抗抗体越多，呈现的颜色越深，因此，间接ELISA中颜色的深浅与待检血清中抗体的含量成正比。

3.操作步骤

在ELISA板上标记号阴、阳性对照位置及样品位置，每孔加入阴阳性血清（一般不需要稀释）和待检血清（按说明书稀释）+37℃孵育30～60分钟+洗板+酶标抗抗体+37℃孵育30～60分钟分+洗板+底物+终止液+读数。

4.结果判定

4.1 试验成立条件

按相应说明书进行，实验成立后，再判定待检样品。

4.2 结果判定

按照计算公式计算后，进行待检样品的判定。

5.注意事项

5.1 每步操作移液量必须精准

5.2 注意事项可以参照上述别的ELISA实验。

三、关于底物、终止液和酶标仪使用波长说明

在上述ELISA实验中常用的底物有两种，一种为邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），OPD产物成棕色，但对光敏感，因此要避光进行显色反应。TMB产物为蓝色。底物溶液应在使用前新鲜配制，底物显色以室温10-20分钟为宜。

用酶标仪测定OD值时，所用波长随底物不同而异，如底物为OPD，测定波长为492nm(2mol/L H2SO4终止)，如底物为TMB，测定波长为650nm（氢氟酸终止）或450nm（H2SO4终止）。