菌落PCR资料

作者：未知来源：生物秀时间：2007-7-21

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

具体方法：

1、PCR混合物的制备

Taq buffer（10×） 20 ul

dNTP（2.5 mM） 5 ul

Primer Forward（50 mM） 10 ul

Primer Reverse（50 mM） 10 ul

ddH2O 147 ul

Taq（2U/ul） 8 ul

total 200 ul

将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

Colony PCR

Amplify SSLP marker (CER 454202) from 51MO5 Agro streaks.

E. coli 51M5 streak used as positive control.

Agro and E. coli streak of 79E22 used as negative control.

1. Mix 10 μl NEB Taq buffer + 90 μl H2O. Aliquot 10 μl of the mix into PCR tubes. Label with the sample name. Touch each streak with toothpick and transfer cells to the buffer in the PCR tubes.

2. Prepare PCR mix on ice:

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For each sample you need For 8 sample mix

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17 μlH2O 17 μl H2O

4 μl NEB Taq buffer 32 μl NEB Taq buffer

5 μl 2.5 mM dNTPs 40 μl mM dNTPs

7 μl CER454202 Fprime (3 μM) 56 μl CER454202 Fprime (3 μM)*

7 μl CER454202 Rprime (3 μM) 56 μl CER454202 Rprime (3 μM)**

0.2 μl Taq polymerase (NEB) 1.6 μl Taq polymerase (NEB)

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Add 38 μl of the mix to each PCR tube and mix gently by pipetting.

3. Run PCR: 95℃ 5 min

95℃ 30 sec, 52℃ 30 sec, 72℃ 1 min, 40 cycles

72℃ 10 min

*2.1 μl CER454202 Fprime (3 μM) 16.8 μl CER454202 Fprime (3 μM)**2.1 μl CER454202 Rprime (3 μM) 16.8 μl CER454202 Rprime (3 μM)

菌落PCR资料

菌落PCR

菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。

操作方法：

1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号

2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟

3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低

5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以

我的做法是：

用头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。

在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。

当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了

我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。

把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。

取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。其他的和普通pcr一样。

我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。

是的，菌落PCR不难。但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。扩培后再作菌落PCR就得到阳性结果了。

我是这样做的,取菌液60ul至ep管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模板,屡试不爽拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了

如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取1ul作模板

模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的PCR里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释

一般来说, 菌落PCR能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果.

一般会出现假阳性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建议引物一个为目的基因一个为载体上的，用无菌牙签挑取菌落，在配好的PCR体系中赞一下，PCR反应条件为95度10分钟94度40秒退火55度40秒72度1分钟30个循环

建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑是否能切出目的片段。

假阳性并不高，可挑菌落摇菌12小时以上再取菌液pcr,初始变性温度可设为98度。

我们一般将接种好的菌液煮沸15min，4000rpm离心5min，用上清作模板，效果很好。

非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手.

1.挑取菌落加入50ul dd水中,振摇.

2.99度, 5'灭活菌液中的酶

3.12000rpm离心1'去除细胞碎片

4.取上清pcr,50ul体系取10ul

我做就是将菌株挑一点点加入PCR体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌落放到37度继续让它长大一些,方便接种.

刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已.

我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀疑;如果似有似无,一般都是假阳性.

菌落PCR ，菌液PCR（菌液的体积不能过大，大了会影响PCR体系，导致扩增不出来，一般取0.3微升左右就行了）都可以的，一般10微升的PCR体系，跑样时用小梳孔，（凝胶使用第一次时做回收用，将溴酚兰及核酸以外的凝胶割下来，就可以再用来做鉴定胶了，一般鉴定用的旧胶用２次都是可以的，比较节省）。

理论上，基因特异性引物和载体上的通用引物都是可以的。最重要的是带marker,先判断大小。当然最后还要提质粒酶切鉴定一下。一般PCR阳性的菌，正确的可能性非常大。但也不排除PCR阳性，但酶切阴性的可能，因为如果基因是PCR后克隆到载体的，可能会存在碱基突变的可能。

所以需要PCR和酶切两种方法鉴定。但最终应以测序的结果为准。

跑得很好的电泳：200v，我的目的片断是400多pb，2%普通胶，跑了大概20分钟左右吧