微生物实习报告

对生活中几种水样的大肠菌群检测和分析

摘 要

本实验对生活中的几个水样，包括自来水、热干面、冰红茶、南湖水，进行了细菌总数和大肠菌群数的测定。对大肠菌群的检测利用了多管发酵法，通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。结果显示：热干面细菌总数、大肠菌群数超标；南湖水细菌总数、大肠菌群数超标，属于污染状态，不宜直接饮用；自来水和冰红茶因操作失误未得到可靠结果。对类大肠杆菌的分析表明，南湖水、校所售的热干面中含有类大肠杆菌。

关键词:水样、大肠菌群、细菌总数、粪大肠杆菌。

Abstract

 In this study, several water samples which are universal　in our life including tap water, dry noodles, iced　tea, water of Nanhu Lake, the determination of total bacteria and coli form counts. Coliform detection using multiple tube fermentation method, by recording the number of positive tubes and check the maximum possible number of tables (MPN) to find out the possible content of the different water samples coli forms. The results showed that: dry noodles bacterial count, coli form counts exceeded; South Lake water total bacterial counts, coli form counts exceeded the polluter of state, should not be directly consumed; water and iced tea did not get reliable results due to operational errors. The analysis shows that the class of E. coli, containing the Nanhu water, dry noodles sold by the school class of E. coli.

Keywords: water samples, coliform bacteria, total bacteria, fecal coliform

1 前言

随着人们生活水平的提高，人们对食品安全的关注度也越来越高。伴随着经济的发展，水体污染现象也越来越严重，而病原微生物造成的污染是其中主要的原因之一。夏季气温升高，食品也容易受到病原微生物的污染，人们使用后会造成腹泻、呕吐等中毒现象，给人们的生活带来很大威胁。因此检测食物、饮用水中的病原菌污染情况显得十分重要。

食品卫生法规定:食品中不允许含有伤寒、副伤寒、沙门氏、痢疾、霍乱等消化系统病源菌，但实际上这些致病菌却难以在各个场合中检测出来。因此，常通过检测与病原微生物有密切关系的指示菌来判断。水体中细菌性污染主要是由人和动物粪便的不合理排放引起的，因此鉴定水体污染的指示菌可选用存在于人体和动物肠道的易于检测的细菌， 通过对这些细菌的检测，判断水体是否受到粪便污染，从而说明是否有被病原菌污染的可能性。由于不同国家的食品种类不同和对粪便指示菌的认识的差异，而对粪便污染指示菌的应用也具有很大的不同，其中多以大肠菌群、埃希氏大肠杆菌、粪大肠菌群、耐热大肠菌群、粪链球菌、肠杆菌科等作为粪便指示菌。世界大多数国家将大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群和耐热大肠菌群作为食品的一类微生物限量标准进行定量分析，大肠杆菌 015： H7作为一个致病菌进行定性检验。

大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，大肠菌群是一群以大肠杆菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸菌属（Citrobacter）、肠细菌属（Enterobacter）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）等，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌。若食品中检出大肠菌群便意味着该食品受到人畜粪便的污染。大肠菌群多数寄生在温血动物肠道内， 在肠道内进行大量繁殖，并随粪便排出体外。被粪便污染的水体中可能有健康人粪便，也可能有肠致病菌携带者的粪便，因此经粪便污染的水体中可能含有肠道致病菌。由于经粪便污染的水中病原菌数量少， 直接检测比较困难， 一般情况下只测定水中有无肠道正常细菌存在。

粪大肠菌群系指一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌，在44.5℃培养24~48h能发酵乳糖产酸产气，是用来表示来源于粪便的大肠菌群。粪大肠菌群是人与温血动物肠道中数量最多的杆菌，其基本形状与大肠菌群相似，而且是总大肠菌群的一部分。美国《饮用水及废水检验的标准方法》第20版中对粪大肠菌群检测的要求也仅是:乳糖发酵管产酸、产气者，转种EC肉汤管，于44.5℃+/-2℃孵育24月h，若产气则为粪大肠菌群阳性，否则为阴性l3]。粪大肠菌群是人类粪便中的主要细菌，具有作为指标菌的一般特征，所以被用来作为评价检品中是否粪便污染的指标菌。粪大肠菌群数的高低，指示了粪便污染的程度，也预示了对人体健康危害性的大小。

我国的食品卫生微生物标准体系主要由菌落总数、大肠菌群和致病菌三大类构成。同时，大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌是食品卫生的三项重要的卫生指标，目前在世界各地广泛采用这三项作为食品卫生指标菌，污染和有害的程度以大肠杆菌最为严重，在检验实践中常有大肠菌群阳性而大肠杆菌阴性的情况。

我国国家标准提供了多管发酵法及滤膜法检测总大肠菌群。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸产气[46]以及具备革兰氏染色阴性，无芽抱，呈杆状等有关特性，采用三步法进行检验，即乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。在乳糖发酵试验中可根据检测的精度确定发酵管数，我国食品中大肠菌群的检测采用的是九管发酵法，在样本处理中选择三个适宜的稀释梯度作为接种浓度，于37℃条件下恒温培养24h，观察产酸产气情况。对产酸或产气的发酵管进行EMB平板分离培养，若大肠菌群阳性样本将会出现典型的具有金属光泽的紫黑色菌落。证实试验时，选取EMB平板上的可疑阳性菌落进行革兰氏染色观察，并接种乳糖发酵管复发酵。最终根据证实试验确定大肠菌群阳性的管数，查MPN表，报告每  100mL(g)大肠菌群的MPN值。多管发酵法容易操作，对操作人员的专业性要求较低，检测费用便宜，无需精密实验仪器，但它耗时费力，完成一个阳性样品的检测需要72h。

菌落总数：在我国食品卫生学评价中，菌落总数是指在每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定基础上，检样中的细菌细胞和营养琼脂培养基混合，于37℃有氧条件下培养后所生成的细菌集落数，其单位是cfu/g(mL)，表示每克或毫升样品里含有多少个菌落形成单位。因此，它只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数，而并不能测出检样中的实际总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不能生长，有特殊营养要求的一些细菌受到了。由此可见，大肠菌群是菌落总数所检细菌中的一小类细菌，出现菌落总数很高，但大肠菌群数很低的检测结果是正常现象。霉菌和酵母菌属于真菌，与菌落总数所检的细菌在分类学上有质的区别;同时，食品中的霉菌和酵母菌计数检测和菌落总数检测在培养基、培养温度和培养时间上均不同，故两者培养出来的微生物种类和数量自然不同。因此，出现细菌菌落总数很低而霉菌和酵母菌超标的情况也属于正常现象。

2 材料与方法

2.1实验材料

新取样的南湖水、华中农业大学生命科学技术学院微生物实验室自来水、华中农业大学桃园食堂二楼新制冷却后的热干面、康师傅1L冰红茶。

2.2 培养基：

（1）单倍乳糖发酵液：猪胆盐 5g（可不加），蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏 3g，乳糖5 g，自来水1000ml，0.04%溴甲酚紫溶液25ml 或者 1.6%溴甲酚紫溶液1ml，pH 7 - 7.2

（3倍乳糖发酵液各量乘以三）

（2）牛肉膏蛋白胨培养基  (1000ml)灭菌条件：121OC，30min,牛肉膏 5g,           蛋白胨10g , NaCl 5g , 自来水1000ml, pH7-7.2（配固体培养基时，加2% 琼脂）

（3）E·C培养液（1000ml，pH7.2-7.4）灭菌条件：115OC，20min,蛋白胨20g ,乳糖 5g ,            三号胆盐1.5 g,K2HPO4 4 g, KH2PO4 1.5 g, NaCl 5g,1.6%溴甲酚紫溶液1ml ,自来水1000ml,     pH7.2-7.4

（4）伊红美兰培养基1000 ml（pH7.2,灭菌条件：115℃ /20 min,蛋白胨 10g ,乳糖 10g,    K2HPO4 2g,自来水1000ml,2%伊红（曙红 cosin）20 ml ,0.5%美兰（Methylene blue）13 ml

2.3 细菌总数测定

2.3.1 主要仪器

采样用空大蓝盖瓶：2瓶,小蓝盖瓶装90ml无菌水：3瓶,试管装9 ml 无菌水：3管,加玻璃珠三角瓶装225ml无菌水：1瓶,灭菌5ml吸头（tip）：1包,灭菌1 ml吸头（tip）：1盒,试管装单倍乳糖发酵液：10ml /管x 30管,试管装3倍浓缩乳糖发酵液：5ml /管x 25管

大蓝盖瓶装三倍浓缩乳糖发酵液：50ml / 瓶x 2 瓶,培养皿（10皿/筒）4筒,牛肉膏蛋白胨固体培养基：200ml / 瓶x 4 瓶

2.3.2 实验方法

将1瓶牛肉膏蛋白胨培养基，融化后倒10皿，以供试材料作10倍稀释（自来水不稀释，用原液作实验），对各样品均稀释至10-2，共三个稀释度（原样、10-1、10-2），每个稀释度做三个重复，用涂抹法（0.1ml）测其中的细菌总数。稀释方法：水域、饮料液体样品做10倍稀释，10 – 1稀释度用5ml吸头吸两次共10ml原液加入瓶装90ml水中，10 – 2稀释度用1ml吸头吸10 – 1稀释液1ml加入试管装9ml水中，热干面或其它固体食品取25克放入225ml无菌水震荡10分钟作为10 – 1再进行稀释；自来水不稀释，用原液做实验。

2.4多管发酵法测定大肠菌群数（利用15管发酵法）

2.4.1 初发酵

（1）南湖水污染液体样品稀释至10-2，以最末稀释度水样接种，接种方法按下所示（接种总量55.5 ml）

（2）豆奶和饮料等干净液体类样品直接如图加入，但隔夜豆奶需稀释10倍，以10-1稀释度水样按下所示接种（接种总量55.5 ml / 样品）。

（3）热干面等固体类样品取25克放入225 ml无菌水振荡半小时后为10-1稀释液。如图以10-1稀释度接种（接种总量55.5 ml / 样品）。

接种发方法：3倍乳糖发酵管，内有5ml 培养液，加被检测水样10 ml，5管重复；1倍乳糖发酵管，内有10ml 培养液，加被检测水样1 ml，5管重复；1倍乳糖发酵管，内有10ml 培养液，加被检测水样0.1 ml，5管重复

（4）自来水接种：在装有50 ml三倍乳糖发酵液的三角瓶中加入自来水100 ml，共2瓶；在装有5 ml三倍乳糖发酵液的试管中加入自来水10 ml，共加10管。（总接种水量300 ml）。

最后将接好菌的发酵管和平板放37OC培养24h，观察乳糖初发酵结果，查MPN表。

2.4.2 平板分离

器材：伊红美兰2瓶

实验方法：取伊红美兰平板3块，取产酸产气乳糖发酵管2管，只产酸不产气管1管，分别用接种环蘸取，在平板上划线，培养温度37OC，24h

2.4.3 复发酵与革兰氏染色

实验方法：挑取在伊红美兰平板上有金属光泽的样品菌落2个、无光泽的样品菌落1个。每个菌落分两部分使用：（1）其中一部分各接种斜面1支（共3支），置于37OC培养。（2）另一部分接种单倍乳糖管作复发酵，每个菌2个重复，置于37OC培养。各培养24h。观察大肠菌群的复发酵结果，取长好的斜面进行革兰氏染色后镜检，并记录结果。

粪大肠杆菌的检测：

和平板分离中一样，取2支产酸产气管和1支只产酸不产气管中各取1ml，分别按种到E·C培养管中，置44.5℃下培养，检验是否为粪大肠菌。每组用1支不接种的E·C做对照

3 结果与分析

表1 稀释平板法测定细菌总数结果

样品	稀释倍数	平板1	平板2	平板2	样品细菌总数cfu/mL
南湖水	10-1	474	242	390	不合格
自来水	原液	170	210	290	223
冰红茶	原液	1	24	3	不合格
热干面	10-1	56	47	66	563

经过与国家饮用水标准规定比较，自来水超标。通过与GB478一84食品卫生检验方法(微生物部分)比较，热干面细菌总量超标。

表2 乳酸初发酵的ＭＰＮ结果

	出现阳性管数
样品	50ｍｌ发酵液瓶数	10ｍｌ	１ｍｌ	1．１ mｌ	１００ ｍｌ中最可能的结果
南湖水		５	４	４	３５０
自来水	缺失	10			缺失
热干面		５	２	０	４９
冰红茶		５	５	５	＞１６００

从表中来看，南湖水超过国家饮用水标准，不宜直接饮用。热干面中大肠菌群数也超过国家面食糕点类卫生标准。冰红茶严重超标可能受到污染。

图１　乳酸初发酵各管的情况（从左到右依次是３倍乳糖发酵、单倍乳糖发酵１ｍｌ、单倍乳糖发酵０．１ｍｌ）

南湖水

冰红茶

自来水

热干面

表３　伊红美兰平板上的大肠菌群的形态

样品	是否有金属光泽
	产酸产气１号	产酸产气２号	只产酸
南湖水	无	有	无
自来水	有	有	缺失
热干面	无	无	有
冰红茶	无	无	缺失

从表中可以看出，南湖水中只有产酸产气２号管产生了酸，自来水两管产酸产气的也是产生了酸。热干面、冰红茶两个产酸产气的管却没有产生酸，热干面中只有不产气的产生了酸。

表４　Ｅ．Ｃ管鉴定

样品	产酸产气１号管	产酸产气２号管	只产酸
南湖水	变色、有气体产生	变色、有气体产生	变色、有气体产生
自来水	变色、有气体产生	变色、有气体产生	缺失
热干面	变色、有气体产生	变色、有气体产生	不变色、有气体产生
冰红茶	变色、有气体产生	变色、有气体产生	缺失

从表中可以看出，在产酸产气的四个样品中有粪大肠杆菌的存在。在南湖水的只产酸的样品中也存在类大肠杆菌，而热干面中则没有。

图２　复发酵结果

从复发酵结果来看，可能纯在大肠菌群假阴性的菌群。

表５　革兰氏染色结果

组员	有金属光泽１号管	有金属光泽１号管	无金属光泽
*	阴	阴	阴
*	阴	阴	阴
*	部分阳	阴	阴
*	阴	阴	阴

从表中来看所监测的菌群多为革兰氏阴性

综合分析南湖水中存在粪大肠杆菌，并且受到大肠菌群的污染较严重，学校所售的热干面中粪大肠杆菌的存在，且受到大肠菌群的污染，产品质量有待提高。

4 讨论

对于表１，出现问题的原因是涂布平板技术不过关，有的涂破了，好多没有涂开。自来水的数据从后面的分析看有两个原因：１）所接种的样品不是自来水，可能是冰红茶或热干面。这是没有标记好的缘故，分工不够明确。２）用来收集自来水的蓝盖瓶不干净，可能拿的是没有清洗的。

对于表２，自来水的数据缺失是由于配好的溶液没有放到培养室，而是被倒了。冰红茶的数据是错误的，原因可能是再调ＰＨ值时没有点酒精灯，或是在调的过程中被杂菌污染了，还有可能是头没有及时更换。

对于表３，出现这种结果可能是因为划线的问题，如划线过程中被杂菌污染。还有可能是出现了假阳性的菌群，或者培养条件不适宜细菌生长。

对于表４，南湖水中只产酸的菌群却产生了气体我们猜测是不是该菌群在不同环境下有不同的呼吸作用。热干面杜氏小管中产生的气泡很小，可能是环境引起的。对于图２，出现没变色的原因可能是假阴性，或是没有接种上菌群。

从本次实验中我们学到了如何设计实验，如何准备材料、如何开展实验。对所研究的问题，有了一定的了解；相关知识背景得到一定的运用。但也存在很多不足，组员分工不够明确，做实验时没有做好记录，实验技术有待提高，配合程度有待加强。

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