分子生物学习题答案_07.06.11

注意：请参照历年题型复习（有判断、填空、名词解释、看图、问答等）

第二章  DNA的复制与修复  

1. 名词解释：

⑴origin：DNA复制是从DNA分子上特定位置开始，此位置称复制起点，是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。

⑵复制叉：DNA正在复制的分叉部位称为复制叉（replication fork）

⑶复制眼：复制的DNA（尤其是双向复制）在电镜下象只眼睛称复制眼（泡）

⑷复制子：基因组中具有一个复制起点和一个复制终点并能在细胞中自主复制的单位。

⑸滚筒式复制：一种单向复制的特殊方式，一般是环状单链分子在复制过程中先形成共价闭环的双链分子（复制型），然后其正链在特定位置切开，游离出一个3-OH末端，然后在DNA聚合酶催化下，以环状负链为模板从正链3-OH末端加入脱氧核苷酸使链不断延长，通过滚动而合成出新的正链。

⑹D-型：一种单向复制的特殊方式，双链在固定点解开进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条保持单链而被取代，在电镜下看呈D-环型。待一条链复制到一定程度露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。

⑺θ式复制：环状DNA的一种双向复制方式，双链从起点处解开并双向复制，呈θ型状，直到复制终点。

⑻端粒：真核生物线性染色体的两个末端具有的特殊结构，由许多成串短的重复序列组成。

⑼SOS修复：DNA受到严重损伤，细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式。修复结果只是能维持基因组完整性，但留下的错误较多，又称为错误倾向修复，使细胞有较高的突变率。

2．名词对比

⑴引物酶和引发体：引物酶即DnaG，是负责DNA复制起始阶段RNA引物合成的酶；引发体指由DnaB解螺旋酶和DnaG引物合成酶构成了复制体的一个基本功能单位。

⑵DNApolⅢ和DNApolⅠ：DNApolⅢ是由多个亚基组成的蛋白质，真正负责从新合成DNA的复制酶；DNApolⅠ是一个多功能酶，兼有聚合酶﹑3′-5′﹑ 5′-3′核酸外切酶的活性，主要起修复酶作用。

(3)DNA复制的先导链和随从链：DNA复制时以3′-5′链为模板连续合成的子链；而以5′-3′链为模板的不连续合成的子链为随后链。

3.简述同位素标记、密度梯度离心技术在分子生物学研究中的应用

⑴15N-标记研究DNA的半保留复制：把细菌放在含15NH4Cl的培养液中培养若干代，分离出的DNA是含15N的“重”DNA，密度比一般含14N的DNA高。用密度梯度离心法，15N-DNA形成的致密带位于普通14N-DNA所形成的致密带的下方。

把含15N－DNA的细菌放回含普通的NH4Cl培养液中培养。细菌在营养条件充足时，20分钟就可以生长成新一代。提取子一代的DNA再作密度梯度离心分析，发现其致密带介于重带与普通带之间，看不到有单独的重带或普通DNA带。

实验结果说明：子一代DNA双链中有一股是15N单链，而另一股是14N单链。前者是从亲代接受和保留下来的，后者则是完全新合成的。密度梯度离心实验，完全支持半保留复制的设想。

含15N-DNA的细菌在普通培养液中继续培育出子二代，其DNA则是中等密度的DNA与普通DNA各占一半这也进一步证明复制是采取半保留式的。实验还可按子3代、子4代……进行下去，15N－DNA则按1／8、1／16…¨的几何级数逐渐被“稀释”掉。

 ⑵3H-标记研究DNA的半不连续复制，即连接酶突变核酸序列特点研究等：用3H脉冲标记大肠杆菌培养物，优先标记的是新合成的DNA。新合成的大多数是一些含有1000核苷酸的短片段，若再将菌放到不带3H的培养基中保温，发现3H出现在大片断中了。若用DNA连接酶突变的菌株作以上测试，3H一直出现在小片段中，说明DNA的复制是不连续的。

4．举例说明染色体外遗传元件的不同复制机制（θ型、D型、滚筒型）

有些病毒（如腺病毒、Φ29噬菌体等）及线粒体DNA的复制是单向进行的，滚筒式属单向复制。质粒整合前为θ式或滚筒式复制，整合后为一个复制子，质粒为双向复制θ式。真核细胞内线粒体DNA的复制方式为D-环复制（D-loop复制）形式。D-环复制特点是两条链的不同步复制。详见名词解释。

5．通过什么实验证明DNApol III合成DNA冈崎片段是以RNA为引物。

以а-32p-NTP标记+未标记dNTP为底物，引发合成后用稀碱处理，水解DNA和RNA的连接处，使RNA上的32p转移到了DNA上，证明RNA为引物。

6．生物体内哪些机制保证了DNA复制的保真性.

DNA聚合酶的校对作用；RNA引物起始复制可减少复制错误；修复系统有多种机制和酶。

7．简要说明沉默突变、致死突变、渗漏突变、进化突变的原因

⑴沉默突变：主要因为密码子的简并性，点突变不引起氨基酸的变化；或者个别氨基酸改变为结构和性质相似的氨基酸，则不影响表形，即基因型（genotype）改变表现型（phenotye）不变。

⑵致死突变：关键氨基酸改变，如酶的活性中心突变，或者发生无义突变，使编码的蛋白质功能丧失，影响生物存活。

⑶渗漏突变：某个氨基酸改变，但基因产物并无重大改变，如酶的Km和Vmax改变。可使生物适应环境或丧失某些功能，可产生新种。

⑷进化突变：发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。

8．什么叫端粒？端粒的结构特点，说明端粒复制的特点？端粒酶在何种细胞中才有活性？

⑴端粒位于真核生物染色体DNA的末端特定的序列结构。

⑵端粒是由简单的串联重复序列组成的。端粒DNA序列有取向性,可以与由蛋白质和RNA组成的端粒酶结合配对，以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA，向5’→3’延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA3’端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次，以对抗DNA复制过程中5’引物消后无法补齐造成的染色体逐渐缩短，维持染色体的长度。

⑶端粒酶在生殖细胞中起作用。

9．DNA复制中都包括那些酶系统和蛋白因子，这些酶在复制中的各自作用是什么？是通过那些试验现象发现的？

（1）解旋酶：DNA复制时，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母链不断解开形成单链；

单链DNA结合蛋白：防止单链DNA形成发卡结构，保持伸展状态，保护单链DNA不被水解；

DNA拓扑异构酶I，使DNA磷酸二酯键单链断裂断裂，形成DNA nick，使DNA可以旋转以释放解链时的张力；

DNA拓扑异构酶II：使DNA复制完毕后“互锁”的两个子代环状DNA解离；

引物酶：引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA作为DNA合成的引物；

DNA聚合酶I的功能a. 5’→3’聚合作用，b. 3’→5’外切酶活性（校对作用），c. 5’→3’外切酶活性（切除修复作用）；

DNA聚合酶III的功能：主要是合成新的DNA链；

DNA聚合酶II的功能：主要与修复有关；

DNA连接酶，借助ATP水解提供的能量，催化DNA单链nick的5’-端与3’-端生成磷酸二酯键。

⑵DNA聚合酶I：可以用dNTP合成DNA链，并且该酶突变使菌易受环境影响而突变；

DNA聚合酶III：DNA聚合酶I的合成速度不能满足菌生长的需要，并且DNA聚合酶I突变的菌仍然可以复制DNA；引物酶：通过以а-32p-NTP标记+未标记dNTP为底物，引发合成后用稀碱处理，水解DNA和RNA的连接处，使RNA上的32p转移到了DNA上，证明RNA为引物，从而发现引物酶。

第三章 DNA重组

1．生物体内DNA重组的类型，各自的不同和生物学意义。

⑴同源重组：真核生物减数过程中，染色体间的物质交换，即DNA分子的断裂和在重组酶作用下的交换连接，细菌中发生在接合过程中，交配的染色体在两个紧密连接的细胞中转移。特点：a.要求较大的DNA片段进行交换；b.存在重组热点；c.整个基因组频率不稳定，受综合和局部效应影响。意义：a.维持生物多样性；b.引起进化；c.瞬间物理连接，对染色单体正确分离到子代细胞，至关重要；d.用于损伤修复。

2位点专一性重组：在专一酶作用下，在DNA特定位点上发生断裂和重接，从而产生精确的DNA重排的DNA重组方式。特点：a.要专一识别位点，交换的为短同源片段;b.需专一酶识别，结合；c.参与该过程的酶的表达被细胞调节过程引发。意义：发生在DNA特殊序列对之间，是噬菌体进入宿主细胞后整合到宿主DNA上的重组形式。

3转座重组：转座子在基因的许多为点间反复插入而实现的重组。特点：移动片段与受体同源性无关；b.真核，原核中均可发生转座重组；c.转座子可沿染色体移动，也可在染色体见跳跃。意义：a.可使原本相距较远的基因结合在一起，形成新的操纵子，产生新蛋白。b.在启动子部位插入可使基因打开或关闭。c.转座发生时，大多数受体基因被纯化，也有基因被激活。d.过多转座对细胞不利，细胞在长期进化中形成了一些不利转座的代谢途径与转座平衡

⑷异常重组：不需要同源性片段，也不需要酶或特异性序列的参与与识别，并以DNA复制完成重组过程，又称复制性重组（机制尚不清楚）。意义：常导致基因破坏而引起突变，与人类遗传疾病，癌症和基因组进化有关。

2．何谓转座子？转座子有哪些类型，研究转座重组有哪些意义？

⑴能够反复插入到基因中许多位点的特殊DNA片段，它们可以从一个位点转移到另一个位点，从一个复制子到另一复制子。⑵分类：简单转座子（插入序列IS），可存在的单元，带有介到自身移动的蛋白；复合转座子，除转座酶基因外，还带有其他功能性基因的转座子，通常是两端为两个简单转座子，中间夹带一个基因片段。⑶研究意义：a.了解进化意义；b.为细胞分化发育提供理论依据；c.有助研究基因机制。

3．说明下列符号意义：IS，Tn5(Tn903,10等)，Mu,D108

答：⑴IS：插入序列，即最简单的转座子。⑵Tn5：复合转座子的一种，带有某些功能性基因。⑶Mu和D108：转座噬菌体，属于温和噬菌体，Mu和D108 DNA经转座可插入宿主染色体的任何一位置，（随即整合）引起突变。

4．转座重组的遗传效应。

⑴引起插入突变：以10ˉ３—10ˉ８频率进行的转座会引起插入突变，IS，Tn,Mu噬菌体都可以引起插入突变，插入位点若在一个顺反子的前端功能基因中，可能造成极性突变。⑵造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复。⑶插入位点出现新基因，复合转座子带有抗性基因，可产生两方面效应：a.靶基因被插入突变；b.靶位点出现抗药基因。⑷转座后供体序列不变，即复制型转座。⑸引起染色体畸变，在一个染色体上如有同一转座子的两个拷贝提供的相同为点，可由重组导致染色体缺失，倒位，插入。⑹切除效应，转座子从原来位置上消失，准确切除，使原插入发生恢复突变，若不准确，会留下转座子残迹，产生插入突变，但转座子标志消失。

5．转座效应意义：参考第一题。

6．何谓同源重组？特点及机制？

⑴定义，特点参见一题。⑵机制：A：断裂-复合机制：a.：断裂复合：发生在染色体复制完成后，每对联会染色体有4个染色单体，在染色单体水平发生DNA断裂，断裂DNA交叉重组，解除张力。b：拷贝选择：姐妹染色单体复制途中各自交换了模板。B：双链断裂启动重组：在受体DNA上形成双链断裂（核酸内切酶），重组开始产生3‘端单链，受体3’-末端迁移至供体同源区，受体3‘-末端修复延伸合成，供体置换，链迁移至受体链，在受体上的另一3’-末端DNA合成，相互迁移产生双链交换。

7．举例说明位点专一性重组。

λ噬菌体DNA入侵宿主基因组进入溶原状态，是通过λDNA和细菌DNA特定的附着位点之间的重组实现的。E.coliDNA上的重组位点affB分为B、O和B’三部分，λDNA上的affP分为P、O、P’三部分，O为核心序列，λDNA的整合和切离都发生在各自的O序列，两侧的序列对重组也有重要作用。λDNA的整合过程无DNA降解，也无DNA合成，只是affB和affP两个位点整合后，一种DNA结合蛋白inf在拓扑异构酶活性催化下，使两个DNA分子的各一条单链断裂，经inf作用，形成重组中间体Holliday结构，然后另外两条单链同样过程断裂重接，完成重组。

8．比较简单转座子和复合转座子。

⑴相同：都是存在染色体可自由复制和位移的基本单位；转座发生时，受体分子中有一段3-126p的靶序列DNA自我复制，转座子插入这两个重复序列之间，不同转座子，靶序列不同。⑵不同：简单转座子：常称之为插入序列（IS序列），可存在的单元，带有介导自身移动的蛋白，长度较小，是细菌或质粒DNA的正常组成成分，所以IS序列只有一个开放读码框；复合转座子：带有一些功能性基因（如抗药性），常由IS序列插入某功能基因，两端形成有功能的复合体，IS序列只能作为复合体移动，其转座能力由IS序列控制或调节；

此外，还有一类不带IS序列的，体积庞大的转座子Tn-A家族，此类带3个基因，分别编码转座酶，解离酶，β-内酰胺酶，且两翼带有38bp发倒置重复序列。

第四章 RNA的生物合成

1．说明或对比以下概念

⑴阅读和阅读框和ORF：阅读在protein合成系统中，指按单向线性对核苷酸序列进行解码的过程。阅读框是指mRNA分子中可转译成protein多肽的3种可能的三联体密码子组合方式之一。ORF：开放阅读框，指从起始密码子到终止密码子的一段基因序列。

⑵编码和读码：编码是指成熟mRNA相邻三个碱基决定一种氨基酸。读码是指氨酰tRNA与mRNA三联体密码的相互识别。

⑶DNA有意义链和反意义链：（＋）有意链，DNA双链中与转录模板互补的链（与mRNA序列相同的链）。（－）反义链，DNA双链中的可以转录成mRNA的链（与mRNA互补的链）。

⑷DNA正链和负链：同上。

⑸启动子和增强子：promotor（广义上讲，是控制转录的各种序列元件的任何组合都可以使用“启动子”术语)。通常是指位于基因5’末端上游外侧，紧邻转录起始位点的一段具特殊功能的非编码核苷酸序列，可与RNApol结合启动基因转录。Enhancer指真核生物的一段特异序列，通过顺式作用方式，能够在距离目标基因50Kb以上位置，从上游，下游等不同位置及方向增强该基因转录活性。

⑹强终止子和弱终止子：终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，富含GC，无需终止蛋白参与即可以使转录终止。弱终止子也有反向重复序列，但无polyT结构，GC少，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。

⑺足迹法和阻滞电泳：footprinting通过检测因受特定转录因子蛋白质结合保护，而不受特定分子如DNase1切割作用的磷酸二酯键区域，从而鉴定出DNA分子中特定蛋白质结合区位置，及其核苷酸序列的一种分子生物学实验技术。阻滞电泳，又称电泳迁移率变动实验，用于检测蛋白质和DNA序列的互相作用，若某DNA片断能和蛋白质因子结合，则其在凝胶中电泳运动的速度就会减慢。

⑻hnRNA和SnRNA：heterogeneous nuclear RNA(核内不均一RNA)，为mRNA前体,指真核生物mRNA初级转录物，在核内加工，形成的大小极不均一的中间产物。(经5’末端加帽，3’末端加尾，拼接去除内含子和核苷酸甲基化等步骤，才形成成熟mRNA)。Small nulear RNA(核内小RNA）真核细胞核内一类长度位90－400核苷酸的小分子量核内RNA，丰度高。可与特异蛋白质结合成核内小核糖核蛋白质颗粒，参与转录物的剪接，多聚腺核苷酸化，3’末端成熟作用。

⑼mRNA前体剪接和修饰：都是mRNA的加工过程。前者是从DNA模板链转录的最初产物中出去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程，后者是mRNA5’加帽，3’加尾的过程。

⑽外显子和内含子(exon, intron)：在DNA分子中基因编码序列常被不编码序列隔开，这种不编码序列叫内含子，编码序列叫外显子。但其划分不是绝对的，内含子也可编码，外显子也可不编码；在一基因中的内含子又可能是另外基因的外显子。

⑾ribozyme与RNA剪切：一些RNA分子具有高度专一的催化活性，在无蛋白质情况下能进行剪切反应，称为ribozyme。RNA剪切是在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中，核中hnRNA剪切掉内含子，然后将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA。

⑿DNApol与RNApol：前者是根据DNA模板链合成互补链的聚合酶。后者是依赖于DNA的RNA聚合酶。

2．简述RNA前体的剪切（剪切位点有何特征、剪切机制、核酶、剪切特异性的意义）

⑴核酶定义见名词解释。⑵剪切位点特征：是保守序列，有共同的结构单元AGGUAAGU；无互补；位于内含子和外显子交界处；以GU开始，以AG结束。⑶机制：酵母中的剪切由两个转酯反映完成，首先分支点A的2’-OH攻击5’外显子剪切位点，形成2’-5’磷酸二酯键，从而形成分支结构；其次，上游外显子3’-OH攻击内含子与外显子2之间的磷酸二酯键，使外显子1和外显子2连接；然后，释放内含子环，整个反应中的磷酸二酯键数量未变。⑷剪切特异性的意义：内含子必须精确的切除，否则会造成阅读框的改变，从而合成非活性蛋白。

3．简述核酶的特征。

ribozyme的大小从十几个nt到数百个nt；底物多为RNA(也有DNA、糖类、氨基酸酯等），ribozyme的催化效率较酶(蛋白质)低得多；必需有Mg2+存在时才能进行催化；它也具有催化作用的专一性。对竞争性抑止剂敏感。可分为剪切型核酶（催化自身或者异己RNA的切割，相当于核酸内切酶。包括：锤头型核酶，发卡型核酶，丁型肝炎病毒HDV及有蛋白质参与协助完成催化的pro-RNA复合酶）和剪接型核酶（具有核酸内切酶核连接酶活性）。

4．举例说明三种RNA前体的剪切和成熟过程。

⑴mRNA：在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。核中hnRNA在核酸内切酶作用下剪切掉内含子，然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA。mRNA的加工修饰包括：5’端形成帽子结构、3’端加polyA、剪接除去内含子和甲基化。⑵rRNA是：初级转录物是一条45SRNA含18S、5.8S和28S rRNAs。转录过程中或刚转录完成时，rRNA中约有1~2%的核糖单位的2’-OH被S-腺苷甲硫氨酸经酶促而甲基化。⑶ tRNA是：tRNA经过剪切、拼接、碱基修饰以及3’-OH端连接-CCA结构成为成熟的tRNA。

疑惑：看第7题好像和这道题是重复的，怀疑这道题是问三种加工方式，即加帽子、加尾巴、剪接。

5．说明真核生物mRNA前体特异性剪接的机制及研究方法。

机制见第2题。研究方法：剪切现象的发现是通过四膜虫的rRNA前体在未加任何蛋白质的情况下，自发的进行剪接来发现的。具体研究可以用PCR介导的点突变等方法来改变基因序列，看对剪切造成的影响，寻找剪切位点的规律。

6．简述原核生物启动子的研究方法（包括选材、技术路线、方法和分析及预测图谱）。

⑴可以利用模式生物比如E.coli等来研究。⑵利用foot printing：当DNA被RNA pol结合时，其覆盖部分不被DNase水解。标记DNA末端，控制适当条件，使每个DNA分子中未与蛋白质结合部分的每个磷酸二酯键都被切割一次，切割位置可通过电泳检测知道，未出现DNA条带的地方即转录因子（RNA聚合酶）结合的地方。⑶然后可以利用突变扫描实验进一步分析启动子区的顺式元件。

7．分别说明tRNA、rRNA、mRNA前体加工包括哪些内容。见第4题。

第五章 蛋白质合成

1．名词解释

⑴核糖体结合技术：用已知的三核苷酸与核糖体去测试结合各种AA-tRNA，通过对不同的tRNA的标记，来寻找与已知三核苷酸结合的AA-tRNA，研究密码子和AA的对应情况。

⑵核糖体与多核糖体：核糖体是蛋白质合成的场所，由几种RNA及多种蛋白质组成的复合物。在蛋白质合成中，mRNA上有多个核糖体协同在翻译，这些多个核糖体构成多核糖体。

⑶简并（兼并）密码子：编码同一氨基酸的不同密码子。偏爱密码子：使用频率较高的简并密码子。

⑷分子伴侣：细胞中帮助新生肽正确组装，形成成熟蛋白质，而本身不是最终功能蛋白组合的分子。

⑸简并（兼并）：一种AA可以由多个密码子编码的现象。

 变偶：m RNA的密码子的第三个碱基与反密码子的配对不是那么专一而存在的摆动性.

⑹密码子的通用性：遗传密码在目前的从低等到高等的各种物种中都是通用的，它们几乎使用完全相同的一套密码；密码子的例外：某些生物或者高等动物的线粒体等中，存在着三联体密码对应的意义与众不同的现象。

⑺无义突变：发生在终止密码处，是有义密码子变成终止密码子或终止密码子变成有义密码子。

⑻错义突变：由有义密码的点突变引起的，突变结果只改变一个氨基酸，通常改变后产生一个性质相同的氨基酸。

⑼信号肽：分泌和跨膜蛋白在合成过程中N端共有序列，至少有一个带正电荷的氨基酸，它能引导跨膜和分泌性蛋白的肽链通过内质网膜到内质网腔。信号肽最终被位于内质网上的信号肽酶切除，因此成熟的分泌蛋白N-端无信号肽。

⑽导肽：为线粒体定位信号，富含带正电荷的氨基酸，丝氨酸含量特别高。

⑾5’UTR：mRNA上5’端的非编码区，通常认为与mRNA和核糖体的识别和结合有关。

 3’UTR：mRNA上3’端的非编码区，通常认为与加polyA尾巴有关，与mRNA的未定性有关。

2.简述遗传密码表的特点及其生物学意义

1)密码的基本单位是三联体密码子，以5′→3′方向、非重叠、无标点的方式编码在核酸分子上。

2)简并性：同一种氨基酸有两个或更多密码子的现象称为密码子的简并性。编码同一种氨基酸的密码子,称为同义密码子。密码的简并性可以减少有害突变，对维持生物物种的稳定性有重要意义。

3)摆动性或变偶性：在密码子的三个碱基中，专一性主要取决于头两位碱基，第三个碱基比前两个碱基专一性小，因此，与反密码子（在tRNA上）互补配对时，第三个碱基有较大的灵活性，当第三位碱基发生突变时，仍可翻译出正确的氨基酸。密码的变偶性减少了密码阅读时的误差，增加了翻译的准确性。

4)通用性：各种低等和高等生物，基本上共用同一套遗传密码。这说明了原核细胞和真核细胞的遗传密码是通用的，它们有共同的起源。

5)变异性：各种不同生物的遗传密码可能出现一些变异，这是生物进化的根据之一。

6)连续性：两个密码子之间没有任何核苷酸加以隔开。因此插入或删去一个碱基，就会导致其后的密码子的阅读框改变，造成移码突变。

7)起始密码子和终止密码子：在种密码子中， AUG既是编码甲硫氨酸（Met）的密码子，又是肽链合成的起始密码子。有3组密码子（UAA、UAG、UGA）不编码任何氨基酸，而是肽链合成的终止密码子。

3.在分子生物学研究中，了解某一生物的偏爱密码子有重要意义，试说明。

由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。在原核生物细胞中，对应于tRNA丰富的密码子称为偏爱密码子（biased codons），而对应tRNA稀少的密码子称为稀有密码子（rare codons）。

不同生物对各种密码子的使用频率不同，高等动、植物中使用频率高的密码子可能在原核细胞中被用得很少。因此了解某一生物偏爱密码子，有助于在基因工程中根据宿主生物偏爱密码子改造基因的编码序列，得到高表达的效果。

4.GUG是Val的密码子，但有时也可作为起始密码子，说明其作为起始密码子和内部密码子在功能上有何不同。

1)GUG作为起始密码子出现时，编码甲酰甲硫氨酸。起始频率为AUG的1/3。fmet-tRNAfmet可与GUG结合，是由于反密码子的5′C变偶为U。

2)当它出现在基因内部时，则被缬氨酸-tRNA 识别，这是一种常用的携带缬氨酸的tRNA。

5.说明温敏突变和冷敏突变产生的可能原因。

1)错义突变：由有义密码的点突变引起，突变结果形成其它密码子，只改变一个氨基酸，改变后产生一个性质相同的氨基酸。因此对蛋白质影响不大，一般仍具生物活性。

2)温敏突变：错义突变产生的蛋白质在常温下有活性，但在高温下构象改变而失活，称为温度敏感突变型。

a)在高温下，多肽链不能折叠成正常的构象而失活（影响分子内氨基酸之间的互作）。

b)启动子突变：突变启动子受阻遏蛋白调节，常温下突变启动子处于阻遏状态，温度过高时阻遏蛋白失活，突变启动子有活性。

3)冷敏感型突变：常温或较高温度下产生正常蛋白，而低温下表现突变。在低温下，多肽链不能折叠成正常的构象而失活（影响分子内氨基酸之间的互作）。

6.何谓抑制基因突变？有哪些类型？各自的生物学效应。

染色体的另一位点或另一基因发生突变而消除或抑制了第一次突变的效果即抑制基因突变。第二次突变抑制了第一次突变造成的表现型（表型抑制），使野生型表现型得以恢复（并非真正的恢复突变）。一般是tRNA基因。分为两种类型：

基因内抑制：同一基因内第二次突变可以使该蛋白的功能部位恢复原来的构象，从而恢复其活性。

基因间抑制：是由于另一基因发生突变而产生抑制的。这另一基因称为抑制基因。抑制基因的作用不是出于改变第一次突变基因上的碱基顺序，而是由于其他方式产生抑制的，如终止密码子的错读，错误抑制突变，移码抑制突变，核糖体错读抑制突变，抑制基因引起正常基因错读。

7.说明影响mRNA寿命的因素有哪些？

总体受细胞，外界环境也有一定影响。

1)5′-P末端容易被降解，如果得到保护则不易降解。

2)3′端pol尾巴中是否有AUUU结构，有则寿命短。

3)功能若是编码细胞周期蛋白的mRNA寿命短。

4)持家基因mRNA长寿。

5)真核生物中及高度分化细胞中的mRNA许多比较长寿。

8.蛋白质合成后成熟和易位包含哪些内容和相应的机制（折叠—修饰—易位、分泌）？

1)大多数翻译初级产物是无功能蛋白。特别是在真核生物中，翻译初级产物要转变成天然蛋白—功能蛋白，需要经过折叠、修饰、剪切加工等过程。原核生物中一些蛋白要分泌至细胞外；真核生物除某些蛋白要分泌外，还有一些蛋白要易位至细胞器（线粒体、叶绿体、核）。总之，蛋白质合成后：

原核生物：折叠、部分剪切、分泌。

真核生物：折叠、剪切、修饰、易位、分泌。

2)蛋白质折叠是由多肽链中的氨基酸顺序决定的，但与环境条件有关。蛋白质折叠与肽链合成同步，体内蛋白质折叠环境远比体外复杂，有许多蛋白因子参与。如酶（蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase  PDI)、肽酰脯氨酰顺反异构酶）和分子伴侣（热休克蛋白70（HSP70））。

3)蛋白质的修饰

a)蛋白质的修饰可发生在蛋白质折叠之前，折叠期间或折叠之后，也可以在肽链延伸期间或终止之后。

b)修饰有利于形成正确折叠。

c)修饰也与蛋白质的易位和分泌有关

蛋白质修饰包括以下几点：

a)末端氨基的脱甲酰化和N–端甲硫氨酸切除（肽脱甲酰基酶、氨肽酶）。   

b)多肽链的水解断裂，如：胰岛素、促肾上腺激素-β-脂肪酸释放因子前体。

c)氨基酸侧链的修饰（二硫键形成、羟化作用、氨基酸侧链的交联、羧化作用、甲基化、糖基化、脂化、ADP – 核糖基化、乙酰化、磷酸化、C-端酰胺基引入、硫酸化）。

4)蛋白质的易位和分泌：

a)易位蛋白：核编码的分泌蛋白、膜蛋白、核编码的细胞器蛋白、线粒体蛋白、ATPase、叶绿体蛋白、溶酶体蛋白、核蛋白、过氧化体蛋白。

b)蛋白质的易位的途径

A.共翻译（co-translation)易位

正在翻译的核糖体通过信号肽插入内质网上的特殊通道结合于内质网上（形成粗糙内质网），并使正在延伸的肽链转移至内质网内。切去信号肽后，蛋白质停留在内质网内，或通过高尔基体转移至溶酶体，或形成分泌小泡分泌出去。

分泌和跨膜蛋白在合成过程中N-端有信号肽序列，它能被信号肽识别颗粒（SRP）识别，使翻译停止。停泊蛋白（DP）与SRP结合，消耗GTP使内质网膜打开一个通道，SRP被释放，新生肽进入易位通道，翻译延伸恢复，跨膜和分泌性蛋白的肽链通过内质网膜和到达内质网腔。信号肽最终被位于内质网上的信号肽酶切除，因此成熟的分泌蛋白N-端无信号肽。

两类蛋白质的去向

①   形成膜整合蛋白

②   滞留在内质网腔、运输到溶酶体或分泌的蛋白

B.翻译后易位

由游离核糖体合成，合成后转移至叶绿体或线粒体等细胞器中。细胞质（胞液）是真核生物核基因编码蛋白质的合成场所。胞质合成的蛋白除定位于细胞质外，大部分被运送到细胞核、线粒体、叶绿体、过氧化体等细胞器中定位。

9.简述mRNA指导合成肽链的机制。

1)起始(Initiation)：包括蛋白质起始的两个氨基酸之间形成肽键之前的反应。这在蛋白质合成中是相对较慢的，通常是翻译的限速步骤。

a)核糖体激活：由两个亚基组成的无活性核糖体首先被起始因子（IF或eIF）激活；

b)起始复合物的形成：小亚基-起始因子复合物、mRNA和起始氨基酰tRNA组合成起始复合物（initiation complex），此步有GTP参与；

c)大亚基与起始复合物结合：起始复合物与大亚基一旦结合，起始因子即从小亚基释放出来，他又可用于另一核糖体的起始。

2)延伸(Elongation)：包括从第一个肽键形成到最后一个氨基酸掺入过程中所有的反应。氨基酸的掺入非常迅速，是蛋白质合成中最快的步骤。

a)结合：对应于mRNA上第二个密码子的氨基酰tRNA进入A位与核糖体结合，需GTP提供能量，还需EF-Tu和EF-Ts参与作用；

b)转肽：在肽酰转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的氨基酸的α–氨基与P位上的甲硫氨酰或肽酰tRNA的羧基发生亲核攻击而形成肽键。新的肽键一旦形成，则P位的tRNA即成为“无负载”的。

c)移位：携带着肽酰基的tRNA连同mRNA从5′→3′方向移动一个三联体的距离，肽酰tRNA从核糖体的A位移动到P位。这个过程由移位酶催化，并必须有功能的GTP参与。与此同时，P位上原有的tRNA转移到E位点释放，核糖体从mRNA的5′→3′方向移动一个三联体的距离，于是下一个密码子进入A位，等待下一个氨基酰tRNA的进入。

3)终止(Termination)：包括释放完整的多肽链及核糖体与mRNA 分离。在肽链延伸过程中，当核糖体沿mRNA移动至终止密码子进入A位时，肽链合成便自动停止。释放因子进入核糖体，使新生肽链从核糖体上释放出来。

10.从某一DNA测序结果知，该DNA已发生了位点突变，但该生物的表型与野生型相同，试分析其表型未改变的可能原因。（抑制突变、兼并密码子、性质相似氨基酸等）

1)简并性：同一种个氨基酸有两个或更多密码子，点突变造成密码子改变，但编码的氨基酸不变。

2)错义突变：由有义密码的点突变引起，突变结果形成其它密码子，只改变一个氨基酸，改变后产生一个性质相同的氨基酸。因此对蛋白质影响不大，一般仍具生物活性。

3)抑制基因突变：第二点突变抑制了第一次突变造成的表现型（表型抑制），使野生型表现型得以恢复（并非真正的恢复突变）。

4)点突变发生在非编码区，导致基因编码的产物不变。

11.蛋白质合成后加工包括那些机制，试就核定位、叶绿体和线粒体定位、溶酶体定位和膜定位蛋白的成熟、加工过程加以说明。

1)核定位、叶绿体和线粒体定位蛋白是由胞质中的游离核糖体和多核糖体合成细胞器蛋白前体，然后进入细胞器，经折叠和剪去转运序列形成成熟蛋白，是翻译后易位蛋白。

a)核定位蛋白：大分子蛋白进入细胞核是一个主动过程。这些蛋白包括基质蛋白（各种转录因子）、DNA聚合酶、RNA聚合酶、染色体蛋白等。核定位蛋白均有一段或两段富含碱性氨基酸残基的转运序列（靶向序列），也称核定位序列。

转运过程：输入蛋白与核定位蛋白结合，停泊于核孔，在水解GTP获得能量的情况下，蛋白复合物进入核孔，输入蛋白亚基释放回细胞质。

b)线粒体蛋白大多数为核编码蛋白。合成的蛋白质分别进入线粒体的不同部位，内膜、外膜、内外膜间隙、基质（衬质）。因此蛋白质进入的途径也不同。

c)叶绿体定位蛋白：类似于线粒体。转运肽也有两部分，分别负责外膜和类囊体膜的通过及定位。但叶绿体编码的蛋白只有一个区域。

2)膜整合蛋白和溶酶体蛋白是共翻译易位蛋白。

a)膜整合蛋白肽链上有一段锚定序列（anchor  sequence),由疏水氨基酸组成，作为终止转移信号（stop-transfer-signal)。此类信号不是在N端，而是位于肽链内部，使肽链插在膜上。此蛋白有时有相间排列的信号序列，使肽链多次跨膜。

b)溶酶体或分泌的蛋白多为共翻译的蛋白质。其中：

✓一小部分滞留在内质网腔中，滞留蛋白C末端有特异序列KDEL，除去则分泌。

✓大多数在内质网加工后转入高尔基体，最终运送至溶酶体、质膜或分泌至胞外。

12.保证翻译和准确形成有功能蛋白质的机制有哪些？

1)DNA中包含的遗传信息：蛋白质的功能是由编码蛋白质的DNA中所携带的遗传信息决定的；

2)转录过程：DNA中的遗传信息通过转录传递到mRNA中，转录过程的保真机制决定了遗传信息的稳定性；

3)翻译过程：在蛋白质的翻译过程中，mRNA上携带的遗传信息以三联体密码的形式，与携带特定氨基酸的tRNA配对，从而翻译出特定的蛋白；

4)折叠、修饰、剪切加工等：大多数翻译初级产物是无功能蛋白。特别是在真核生物中，翻译初级产物要转变成天然蛋白—功能蛋白，需要经过折叠、修饰、剪切加工等过程。

5)蛋白质的易位和分泌：大部分蛋白的功能都只能在特定细胞、组织中才能表现出来，因此在胞质中合成的蛋白质需要转运或分泌到特定细胞、组织中才能发挥特有的功能。

第六章基因组的分子结构和组织

1.比较概念

●基因：ＤＮＡ分子上具有特定功能的（或具有一定遗传效应的）核苷酸序列。 

顺反子：决定一条多肽链合成的功能单位。

基因常狭义指顺反子，即为最小的遗传功能单位。但随着研究的不断深入 ，内含子、基因、假基因、编码功能RNA的核酸序列等都是基因概念的延伸。

●卫星DNA：含有异常高或低的GC含量的高度重复序列。

高度重复序列的微卫星DNA ：重复单位很短的一类高度重复序列，普遍存在于真核生物。

卫星DNA主要构成着丝粒，功能和维持染色体的结构、同源染色体的联会有关。而微卫星DNA主要分布于非编码区和端粒区，因核心序列重复次数不同而具有高度多态性。 

●中等重复序列：基因组中重复序列较长、重复频率为103～105的序列。

单拷贝：基因组中只存在一个或2-3个拷贝序列，亦称非重复序列。

大多数的蛋白质结构基因属于单拷贝，而一般细胞内需求量较大的蛋白（如组蛋白）和RNA（tRNA）基因属于中等重复序列，但中等重复序列一般不是编码序列，而在中起重要作用。  

●基因家族：基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，它们往往集中在一起，但也有分散排列的，甚至于不同的染色体上。属于同一家族的各成员也并非都具功能。

●基因组：一个物种单倍体的染色体所携带的一整套基因。

●功能基因组    ：以基因功能鉴定为目标 ，又称后基因组（postgenome）。包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。

2.举例说明测定卫星DNA的实验。

原理：各种DNA在CsCL密度梯度离心中，平衡时的密度浮力决定他的G+C含量，含量越高，浮力密度越大。由于卫星DNA含有异常高或低的G+C含量，使它们与大多数DNA具有不同的浮力密度，因此，会在主要的DNA带的附近伴随一个次带（或前或后）。

实验：小鼠的基因组中有为数很多的卫星DNA，约占基因组的10％。

将提取的小鼠肝细胞中的基因组DNA进行适当的酶切至数千核苷酸长度，进行CsCL密度梯度离心，其浮力密度曲线是覆盖一定密度范围的一条宽带，但有些DNA片段会出现主带的前面或后面——这些DNA就是所谓的卫星DNA。

3.比较原核生物和真核生物基因组的特点。

原核生物基因组的特点1：A1基因组小，一般具有单一的复制起始点；B1.单个染色体，一般呈环状；  C1.染色体DNA不合蛋白质固定的结合 ；  D1.重复序列少;  E1.不编码的序列很少；F1.功能相关的基因构成操纵子，高度集中，转录成多顺反子mRNA；G1.基因有重叠。                  

真核生物基因组特点2: A2.基因组大，具有多个复制起始点；B2.基因组包含多个染色体，一般均为线状DNA；C2.与组蛋白稳定的结合；D2.大量的重复序列存在，将单拷贝基因分隔开；E2.有比例很大的不编码序列；F2.功能相关的基因集中程度不如原核生物，不以操纵子形式组织；G2.基因断裂，被内含子分隔。

4.述基因组织对生物体生命活动的意义。（不清楚，请大家自己找答案。“基因组织”这个词很可能是gene organization，也叫“基因组构”。可能是问基因上各种元件的作用）

5.就你阅读过的资料，说明目前基因组研究主要包括哪些内容，主要采用了哪些研究方法；功能基因组研究又包括哪些内容，主要采用哪些方法。（本题比较多，为了帮助大家理解，个人根据情况可进行适当的删减。）

基因组学研究：

(1)基因表达概况研究，即比较不同组织和不同发育阶段、正常状态与疾病状态，以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异，技术包括传统的RTPCR，RNase保护试验，RNA印迹杂交，但是其不足是一次只能做一个。新的高通量表达分析方法包括微点阵，基因表达序列分析，DNA芯片等；

(2)基因产物-蛋白质功能研究，包括单个基因的蛋白质体外表达方法，以及蛋白质组研究；

(3)蛋白质与蛋白质相互作用的研究，利用酵母双杂交系统，单杂交系统，三杂交系统及反向杂交系统等。

基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，往往被称为后基因组学，利用结构基因组所提供的丰富信息资源，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质系统的研究。功能基因组学以高通量、大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，研究内容涉及基因表达谱的绘制、基因功能的研究、基因表达研究、模式生物和比较基因组学研究等。

采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，基因表达差异分析以及mRNA差异显示等。由于这些技术不能对基因进行全面系统的分析，因而产生了一批新技术，包括基因表达的系统分析（SAGE），cDNA微阵列，DNA 芯片以及蛋白质芯片等。 鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体，进行比较基因组学的研究。此外，可利用诱变技术测定未知基因，基因组多样性以及生物信息学的应用。

第七章 原核生物基因表达

1．名词解释

⑴组成型合成：是指在操纵基因或基因发生突变，导致结构基因的表达不能被阻遏，即在没有诱导物的情况下也能进行转录。 

组成型蛋白：是指数量和合成不受外界环境影响的蛋白质，有的组成型蛋白是系统突变造成组成型合成的结果。

⑵溶源途径：也叫温和噬菌体途径，指噬菌体基因组整合到细菌基因组上，一起复制，不引起噬菌体的组装和细菌的裂解。

溶菌途径：指噬菌体相关基因表达，进行复制、组装并导致细菌裂解和子代噬菌体的释放。

⑶操纵子：是原核生物基因表达的协调单位，通常由功能上相关的几个结构基因及启动子、操纵基因、调节基因组成，转录后形成一条多顺反子。

操纵基因：调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的结合位点，导致结构基因的正、负。

⑷衰减子：是位于结构基因上游前导区的终止子，它能在翻译水平上控制结构基因转录的终止，通常存在于

合成代谢基因中。

增强子：是在真核生物中，距离起始位点很原的，可以大大增强基因转录的序列。

⑸强启动子：转录起始效率高的启动子序列，通常含有－10及－35两个保守区域。

弱启动子：转录起始效率低的启动子序列，通常在－10及－35区域的核苷酸有多处替换，导致启动子结合力下降。

⑹基因重叠：指某些原核生物尤其是病毒的基因组中，存在多个基因部分重叠或相互包含的现象。

操纵子重叠：指操纵基因通常与启动子临近或重叠，与调节蛋白结合后，会影响启动子与聚合酶结合。（不确定）

⑺Ara的c蛋白：是阿拉伯糖操纵子中的调节基因编码的阻遏蛋白，在没有阿拉伯糖时，它结合于启动子区域，阻遏基因表达。

CAP：代谢物激活蛋白，在细胞能量缺乏时，和cAMP结合，激活相关能量代谢基因的表达。

2. 设计试验证明某一突变是调节基因突变或操纵基因突变。

⑴实验设计：将正常细胞和突变型细胞融合成杂合二倍体，并使其处于无诱导物的条件下，测定结构基因的表达情况。若其结果无组成型合成，则说明一定是调节基因突变；若有组成型合成，则是操纵基因突变。

⑵原理：若调节gene突变，则其中正常染色体可合成活性阻遏蛋白，与正常及突变染色体上的操纵基因结合，阻遏结构基因表达。

若操纵基因突变，则调节基因产生的阻遏蛋白虽有活性，但是不能于操纵基因结合，因而不能阻遏结构基因表达。

3. 简述lac操纵子的正负（自己翻书仔细看看）

⑴乳糖操纵子通常为负，即，在无乳糖时，调节基因编码的阻遏蛋白和操纵基因结合，抑制结构基因的表达；若有乳糖或类似物时，乳糖等和阻遏蛋白结合，阻遏蛋白脱落，结构基因可以表达。

⑵正，当有乳糖或类似物存在，并且没有葡萄糖时，细胞产生cAMP，与CAP结合，形成的CAP－cAMP复合物可以与启动子上相应部位结合，激活结构基因的高效表达。但若有葡萄糖时，葡萄糖的代谢中间产物可以抑制cAMP的形成，而单独的CAP不能激活基因表达。

4.说明gal操纵子的特点，从其启动子的结构说明gal在有或无葡萄糖时都可以启动，但是表达水平有很大差异，其意义何在？（自己翻书仔细看看）

⑴gal操纵子有2个启动子p1和p2，两者有重叠，p1需要cAMP－CAP激活才能启动，而且是高效表达；p2在p1上游，不需要cAMP－CAP就可以表达，但是效率低；cAMP－CAP结合位点在p2附近，即，有cAMP－CAP结合时，p2不能结合启动子。

⑵在有葡萄糖存在时，不能形成cAMP－CAP复合物，p1不能启动，但是p2可以低效启动；

没有葡萄糖时，cAMP－CAP复合物结合，阻碍p2与聚合酶结合，但是激活p1高效表达。

⑶意义在于，gal是合成细胞壁组分的重要前体物质，同时也是可以作为能量物质的。细菌在缺乏葡萄糖时，要高效表达gal基因，利用gal提供能量；在能量充足时，也需要少量代谢gal，产生合成细胞壁的物质，这就通过p2的启动来实现。

5．说明ara操纵子和其蛋白C的操纵子的正负。（自己翻书仔细看看）

⑴参与ara代谢的酶分布在3个操纵子中，即araBAD(与代谢ara相关的三个酶)、araE、araFG（与转运ara有关），但是都受一个共同的调节基因产物C蛋白。

⑵有葡萄糖无ara时，araC少量表达，C蛋白结合于操纵基因O2及I区，形成回折结构，封闭了araC及araBAD基因。

⑶有葡萄糖有ara时，C蛋白结合于O1及I区，形成直线结构，封闭了araC基因，打开了araBAD基因，但是没有cAMP－CAP复合物结合，araBAD启动效率很低。

⑷无葡萄糖有ara时，结果类似⑶，但是此时有cAMP－CAP，araBAD高效启动。

6．说明葡萄糖对糖利用型操纵子的调节。（自己翻书仔细看看）

⑴葡萄糖对糖利用型操纵子的调节是通过调节cAMP的含量来进行的，即葡萄糖效应，当葡萄糖存在时，其代谢中间产物可以抑制腺苷酸环化酶，同时激活磷酸二酯酶，导致cAMP水平极低；反之，无葡萄糖且细胞缺乏能量时，cAMP水平升高。

⑵糖利用型操纵子一般都需要CAP（分解物激活蛋白）与cAMP结合形成复合物，结合在启动子附近，进而极大的促进RNA聚合酶与启动子的结合，高效转录糖利用相关基因。

⑶若有葡萄糖存在，则没有cAMP- CAP复合物形成，糖利用相关基因不能有效转录，这样符合生物节省能量的原则，优先利用容易利用的物质。

7.说明色氨酸操纵子的正负（自己翻书仔细看看）

trp操纵子的前导区中有转录终止信号，即衰减子。

Trp是辅阻遏物，可与阻遏蛋白结合，一起结合到操纵基因上，阻遏转录，这是合成代谢基因的常见的反馈抑制模式。

Trp操纵子还有一种更精细的调节方式，若细胞中trp水平低，阻遏蛋白本身无法与操纵基因结合，转录起始，随后翻译开始。若细胞中还有低水平的trp，可以使得核糖体顺利通过衰减子区的两个trp密码子，则前导区RNA形成类似于终止子的茎环结构，导致转录终止；若细胞中trp水平非常低，则RNA无法形成茎环结构，转录继续，可以表达合成trp的相关基因。

8.简述氨基酸合成型操纵子的共同特点

⑴氨基酸合成型操纵子的前导区序列都可以形成衰减子结构。

⑵影响形成“茎环结构”或“poly u”结构的突变都会降低衰减子的作用，增加结构基因的表达。

⑶前导区特异密码子突变成其他密码子，则衰减子只能起到终止作用。

⑷衰减子中需要翻译，利用原核生物转录和翻译几乎同时进行的特点。

⑸都属于一种反馈抑制的模式，合成的终产物抑制基因表达。

9．说明半乳糖操纵子两个启动子的意义。见第4题。

10.说明E.coli外膜通透蛋白基因的反义机制（自己翻书仔细看看）

⑴E.coli外膜通透蛋白表达是受于其mRNA互补序列的小分子RNA的。

有两种外膜通透蛋白：OMPC和OMPF，两者化学性质类似，功能相同，在细胞中总量不变。他们为适应性合成，即，高渗下OPMC合成增加OMPF受抑制，低渗下OMPF合成增加，OMPC受抑制，但总量不变。

⑵ENV为渗透压感受蛋白，在低渗透压下，它与ompF 的区结合，转录ompF，最终翻译成OMPF；在高渗透压下，ENV与ompC的区结合，转录并翻译ompC，同时ENV也能激活CX28序列和ompF的转录，但CX28的转录产物为一段小RNA，可以和ompF的mRNA互补形成双链，导致ompF不能翻译成蛋白质。

11．简述λphage的溶源和溶菌途径。

⑴溶源途径：也称温和途径，λphage感染E.coli后，其基因组与细菌染色体整合，成为染色体DNA的一部分，随着染色体的复制而复制。将这种整合有噬菌体基因组的细菌称为溶源菌，此时λphage上的功能基因大部分关闭。

⑵溶菌途径：λ－DNA从细菌染色体上分离，形成环状，其上基因按照一定的时间顺序表达，并在一定程度上利用寄主的复制、转录、翻译系统及营养物质来合成λphage复制所需的蛋白和酶及基因组，进而组装成噬菌体颗粒，溶破细菌，释放子代噬菌体。

12．转录水平是生物基因表达的主要机制，这一水平是否是唯一的途径？

不是唯一的途径，除此之外主要是翻译水平的调节：

⑴核糖体蛋白基因表达的，关键蛋白结合的rRNA与核糖体蛋白的mRNA有同源性，因此，rRNA与核糖体蛋白的mRNA竞争性的结合关键蛋白，当核糖体蛋白的mRNA多时，关键蛋白较多的与mRNA结合，导致其不能有效的翻译出核糖体蛋白。

⑵稀有tRNA对翻译的，翻译起始后，其速度受mRNA上个密码子对应的AA－tRNA供应能力的，若是稀有密码子，所识别的是稀有tRNA，胞内含量低，导致供给不足，翻译速度降低。

⑶细菌营养缺乏的：营养缺乏时，产生报警物cAMP，促使细菌表达能够利用其他糖的基因。缺乏氨基酸时，产生报警物ppGpp，抑制转录起始及翻译及多数耗能过程。

⑷反义RNA，即与mRNA互补的一段小分子RNA序列与mRNA结合，从而抑制其mRNA翻译。

⑸mRNA二级结构的调节，mRNA形成的各种二级结构可以对转录的终止、翻译的起始、mRNA的寿命等造成影响。

13．设计一个实验，研究某一原核基因的启动子。参照第四章第6题。

第八章 真核生物基因表达

1．比较概念

⑴顺式作用元件反式作用因子：真核生物的序列往往包含许多元件（保守序列），其上可结合各种蛋白，此元件即为顺式作用元件。能与顺式作用元件结合的可扩散的蛋白称为反式作用因子。

⑵基础转录因子：启动子在启动RNA合成必需因子，与RNA聚合酶结合形成围绕在起始位点周围的复合物。上游转录因子：识别并特异地结合在上游顺式件上，其活性不受，可作用于具有其识别序列的任何启动子上。

⑶诱导因子：其作用与上游因子相同，但它们是受的。通用因子：与通用启动子序列结合的转录因子？

⑷DNA结合结构域：蛋白上所含有的能与特殊DNA序列结合的结构域。活性结构域：转录因子所含有的能与其他蛋白结合的结构域。

⑸同源异型域：与发育相关的蛋白上与DNA结合的结构域。

同源异型基因：用同源异型突变鉴定出来的基因，着胚胎发育。

⑹同源异型盒：DNA上编码一类与发育有关的蛋白上与DNA结合的结构域序列。

⑺应答元件：与诱导因子结合的顺式作用元件。

⑻增强子：在真核生物中，还发现某些序列可大大增强启动子的转录，而它们离转录起始点的距离可以很远，可在上、下游其作用，这样的序列称为增强子。沉默子:与增强子相比，起负作用的序列称为沉默子。

⑼启动子：promotor（广义上讲，是控制转录的各种序列元件的任何组合都可以使用“启动子”术语)。通常是指位于基因5’末端上游外侧，紧邻转录起始位点的一段具特殊功能的非编码核苷酸序列，可与RNApol结合启动基因转录。

⑽转录本：加工成熟的mRNA？

⑾转录因子：真核生物RNA聚合酶不能识别DNA上的结合位点，识别这些序列的是调节转录的反式作用因子，即为转录因子。

⑿持家基因：一个仅含有被基础因子和上游因子所识别的元件的启动子能在任何细胞中进行转录，能被此类启动子转录的基因即持家基因，其功能为所有细胞所必须的。奢侈基因：仅在某些种类的细胞中表达的基因。

⒀RNA编辑：在RNA水平上发生的碱基取代，插入和缺失。剪切：转录初产物去除内含子拼接外显子的过程。

⒁螺旋-转角-螺旋：是常见的转录因子的DNA结合结构域，有2个alpha－螺旋和一个beta－转角组成。螺旋-环-螺旋：有两个alpha螺旋和一段loop组成，是常见的转录因子间相互左右的结构域（二聚化结构域）。

2．说明真核生物表达的不同层次。

⑴DNA和染色体水平的。包括：基因重排、基因扩增、DNA修饰、基因封闭（染色体结构）。

⑵转录水平的：包括转录起始、延伸的弱化、终止都会对mRNA前体水平产生影响，是重要的水平。

⑶转录后RNA前体加工及转运的. 真核生物转录和翻译不偶联,转录出的mRNA前提经加工才能成熟为翻译模板mRNA，此过程包括剪切、修饰、编辑、5’和3’端的修饰及转运到翻译场所等。

⑷翻译水平的：包括核糖体的磷酸化/去磷酸化调节，poly(A)的调节，移码和通读等等。

⑸翻译后水平：包括翻译产物的剪切、修饰（如糖基化、磷酸化、切除信号肽、脂化及构象形成、转运和装配形成复合蛋白体）

⑹mRNA降解的，随生长发育和外界环境改变、细胞中蛋白质种类也在不断变化，原有mRNA要降解并以新mRNA代之，因此mRNA是有一定寿命的、细胞中有控制mRNA寿命的机制。

3.试述真核生物DNA水平与遗传稳定性的关系？

⑴基因封闭：A: 组蛋白与DNA结合形成核小体，进一步形成超螺旋及螺旋管结构，对DNA起封闭作用H2A、H2B、H3、H4等组蛋白中碱性氨基酸较多主要起封闭DNA使其不能转录的作用。B: H1为核小体间连接的DNA上的组蛋白，其N-末端为酸性氨基酸,C-末端为碱性氨基酸，H1的作用：与基因有关（以三种形式与DNA结合，其中的方式与接缝封闭有关），维持染色体高级结构。

⑵基因丢失：A：在个体发育中，细胞分化时一些不需要的基因被消除，目前只在低等真核生物中发现，高等生物尚未发现，也能存在高度分化的体细胞中，不易找到，也可能高等生物中无此现象。B：低等真核生物如：原生动物、昆虫、甲壳纲动物等中，马蛔虫受精卵中只有一对染色体（2n=2），生殖细胞保存着个体发育必需的全部基因，在体细胞中，染色体碎裂成很多片断—所谓小染色体，小染色体中具有着丝点的在细胞中得以保存，其他丢失。从而决定了细胞分化的方向，许多原核生物有两种类型的核：大核和小核，小核为生殖核。C：高等真核生物是否具有基因丢失，有试验证明为丢失，核代换试验：说明分化的肠细胞核未发生基因丢失，但在高等多倍体生物的数万甚至数十万基因中，丢失少数基因是否能用目前的实验手段检测出来，还有疑问。

⑶基因扩增：A：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增加的现象，使细胞在短期内产生大量专一基因满足生长发育的需要，使基因活性的一种方式，扩增基因不在染色体上，保证生物体基因组不变，或扩增基因不用后迅速消失或形成均染色区。B：非洲爪蟾卵母细胞rRNA的DNA水平调节。C：果蝇的不分离的多次赴致使基因扩增。D：生理适应性扩增。

⑷基因重排：基因重排在转录前发生，在分化细胞中尤为突出，基因重排分两大类：A：非定向重排，如转座子在染色体上的移动，可使某些基因缺失或失活致使遗传不稳定。B：定向重排，如小鼠免疫球蛋白结构基因的表达，使远离启动子的基因位置到距启动子很近而被启动。

⑸基因修饰：A：基因修饰发生在DNA水平，主要包括甲基化修饰（主要出现在C、组蛋白CpG）及转座子插入等。B：甲基化修饰因影响DNA构象而影响DNA和参与起始转录的一些蛋白质互相作用，从而影响转录起始。

4.什么叫基因沉默（现象、实验），引起基因沉默的原因有哪些？

通过对染色体区域的修饰来把排斥基因上大片段的DNA封闭，称为基因沉默？基因不表达称为基因沉默? 基因沉默有位置效应，有转录水平的沉默，还有转录后水平的沉默。是一种位置效应，基因因他所处的位置而沉默，而不是一种对环境某一特异信号的应答反应。

最常见的沉默形成与被称为异染色质的一种致密形式的染色质有关，在光学显微镜下的外观与常染色体相比看起来很致密，如果用实验方法将某个基因转移到该区域，那么该基因通常被关闭。在酵母中，沉默由组蛋白的脱乙酰化与甲基化作用介导。

在哺乳动物中，DNA甲基化与沉默状态的基因有关，事实上，哺乳动物基因组上大片段的区域，正是通过这种方式被标记，并且DNA甲基化通常出现在异染色质区域，这是因为甲基化的序列通常被DNA结合蛋白（如MeCP2）识别。DNA结合蛋白可以募集组蛋白脱乙酰酶和组蛋白甲基化酶，而这两种酶可以修饰邻近的染色质，因此DNA甲基化可以标记随后异染色质形成的位点（见课本内容）。

原因：①点突变、无义突变导致肽链长度变化，原活性丧失，致死突变、使酶失活

      ②抑制基因突变，抑制了该基因表型显露

      ③转座子插入，使致失活

      ④该基因修饰如甲基化使之封闭

      ⑸RNA干扰导致基因沉默

5.简述真核基因启动子的研究方法（可加图示），何谓突变扫描实验，此技术在基因表达中有何用途。

突变扫描实验：逐个改变起始位点上游碱基（点突变）观察各位点对启动子转录效率的影响。

用途：确定某基因表达的影响位点，如DNA Pol酶II的启动子、TATA、GCbox、CAAT等。也可确定增强子的作用片断，从而可以深入研究基因的机制。启动子研究方法：（可能是）阻滞电泳法、足迹法、甲基化修饰等

6.简述转录因子的DNA结合结构域和活性结构域的结构与特点。

⑴DNA结合域一般较小（60-90AA）已发现结构域有 A：Zn指，锌指蛋白和类固醇受体中，有一小组AA与Zn2+结合形成指状突起，识别DNA大、小沟中特异序列;B：螺旋—转角—螺旋（HTH）通常会有多个与DNA相互作用的氨基酸残基结合与DNA的大沟中。

⑵活性结构域，与DNA结合的蛋白常是二聚体或四聚体，两种结构：亮氨酸拉链，两分子蛋白α螺旋区通过疏水链形成二聚体，其间每6个AA有一个亮氨酸，其碱性区与DNA结合于DNA的大沟中；helix—loop—helix在不同条件下形成不同的二聚体。

7.真核生物表达一般是正，但有负，请分别说明。

答：在真核基因转录的中，既有用激活物的（正），也有用阻竭物的（负），二者同等重要，真核中虽然既有正又有负成分，但目前为止已知主要是正，而且一个真核基因通常有多个序列，必须有多个激活物同时特异结合上才能启动基因的转录。（应该举点例子）

8.为什么内部启动子可以启动转录而不影响转录产物的准确性。

内部启动子启动转录时所结合的转录因子分两大类：即结合于起始位点处的必须因子和辅助因子（在下游），转录启动后，下游辅助因子从结合位点脱落，故不影响转录产物的准确性，如RNApol酶III内部启动子I、II；I：THIIIA结合于box C处THIII C结合与其下游协助THIII B结合在起始位点后，转录开始THIIIA、THIII C脱落； II：THIII C直接结合于boxA和boxC诱导THIII B结合在起始位点处，启动转录THIII C脱落。

9.上游元件多样性对真核表达的意义。

上游元件使得更多的转录因子结合，使转录正确定位。

⑴真核生物基因表达是一个精确过称，只有多样的上游元件才能满足其特异性要求；

⑵各种转录因子存在其自身缺点，如基础因子保守、诱导因子随机排列，单独无法完成基因精确，故需要各类因子结合，因此需要多样上游元件与之匹配，（RNApol酶不能直接与启动子直接结合，需上游因子诱导、启动子需强启动子增强转录）。

⑶利用有限反式因子产生更多方式，减少物质能量的浪费

10.什么叫应答元件，说明其特点及作用原理。

⑴被诱导转录因子识别和结合的上游DNA短序列，受同一诱导因子（如激素、热休克）等的基因，其应答元件相同，此应答元件被同一起调节作用的转录因子识别。

⑵特点：是启动子上游元件或增强子元件；都会有短的保守序列，在不同的基因中均有宝树形，但不完全相同；转录因子结合区大于元件保守序列；元件与起始点（+1）没有固定距离，通常在上游小于200bp处；一个元件可引起应答调节，但有时又多拷贝。

⑶作用原理：当某一基因需要表达时，则与应答元件结合的转录因子合成或活化，与应答元件结合，此转录因子是聚合酶启动转录的必须因子，其结合DNA启动转录和蛋白质合成，使调节效应出现。

11．真核生物启动子元件具有保守性，一种元件可以在多个基因启动子中出现，而一个转录因子也可以作用于多个基因，以上说法对吗？具体说明。

⑴以上说法正确。真核表达的特点就是由多种不同的顺式元件和反式因子组合而成的复杂的以正为主的体系，是模块化的组合。不同基因的启动元件可以由相同的元件构成，同理，同一个反式因子可以作用于所有含有相应顺式元件的基因上。

⑵比如SV40含有6个GC框；TK启动子含有1个octamer框，1个CAAT框，2个GC框；H2B启动子含有2个octamer框，2个CAAT框。每种顺式元件需要特定的反式因子来识别，具有相同元件的基因，需要相同的反式因子来作用。各种启动子中，上游元件的种类、数量、位置都不固定，造成了丰富多样的组合，满足了真核生物海量基因的需要。当然，核心元件，如TATA框，各个启动子中含有的数量和位置都是保守的。

12. 说明真核中多种蛋白因子（转录因子）对基因特异性表达的意义。

真核中多种蛋白因子（转录因子）对基因特异性表达具有非常重要的意义，表现在：（1） 真核生物基因组大，基因种类多，准确选择，使其某一个基因表达必然需要一个十分精细的过程。（2）转录因子中，基础因子有较强的保守性（其结合序列的保守），单靠这些转录因子难以选择特异性表达基因的启动子。（3）调节（诱导）因子的随机排列不能产生功能转录，一个有功能的转录过程必须有多个转录因子的顺序性特异结合，并同时与具有一定序列的DNA序列匹配结合，才能保证正确选择靶基因。（4）真核生物大多数细胞高度分化，在分化细胞中只有少数基因表达，多个因子形成精细的正。（5）若为负，则为了阻遏大多数基因表达。细胞要合成多个负因子—阻遏蛋白，必然给细胞造成大量能量和物质的消耗。

13. 简述转录水平调节和转录后调节。

(1)真核生物在转录水平上的调节主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的。当反式作用因子和顺式元件结合后，将影响转录起始复合物的形成，从而影响转录的起始和效率。

a、启动子和增强子的顺式作用元件

真核细胞基因的启动子由一些分散的保守序列组成，其中包括TATA框、CAAT框和多个GC框等，后两个均属于上游控制元件，由增强子、沉默子及其应答元件进一步调节转录活性。增强子能促进转录，他由比较集中的保守序列组成，增强子具有组织特异性，他优先或只能在某种类型的细胞中表现功能，增强子常存在与DNA酶的超敏感部位。增强子与启动子之间距离对活性并无影响，因为DNA可以弯曲，结合在增强子的反式激活因子能与转录复合物相作用，位于增强子的应答元件可调节增强子的活性。

b、调节转录的反式作用因子

调解和控制转录活性的蛋白质有三类：基本转录因子、上游因子和可诱导因子。基本转录因子结合在TATA框和转录起点，与RNA聚合酶一起形成转录起始复合物；上游因子结合在启动子和增强子的上游控制位点；可诱导因子与应答元件相互作用。所有结合DNA的反式作用因子都有结合DNA的结构域，并由一些共同的结构结合DNA的基序结构主要有：螺旋-转角-螺旋，锌指结构，亮氨酸拉链，螺旋-环-螺旋等。

（2）转录后水平的调节

在真核细胞中，基因转录的最初产物是前体mRNA，其长度比成熟mRNA的长的多，经过剪切和拼接（剪切掉内含子，把几个外显子拼接起来），戴帽（在转录后的mRNA5端加上一个甲基化的鸟嘌呤核苷酸），加尾（在3端加上多聚腺嘌呤核苷酸），可得成熟的mRNA分子，由不同的转录起点和终点转录的产物，以及内部不同拼接点进行拼接，加上不同编辑，可得到不同加工的mRNA，他们翻译成不同的蛋白质。

14. 在生物中存在一个基因可编码（表达出）多种蛋白的原因（转录水平剪切，可变剪切和翻译剪切）。

在真核生物中存在着一个基因可编码多种蛋白的情况，可能机制如下：

（1）翻译剪切：在真核细胞中，基因转录的最初产物是前体mRNA，经过剪切和拼接，戴帽，加尾，可得成熟的mRNA分子，由不同的转录起点和终点转录的产物，以及内部不同拼接点进行拼接，加上不同编辑，可得到不同加工的mRNA，他们翻译成不同的蛋白质。

（2）可变剪切：有些基因产生的mRNA可按不同方式剪接，即可变剪接，产生两种或多种mRNA。可变剪接产生的mRNA编码框不同，因此产生不同的蛋白质。有以下三种情况：

a、可变剪接使多种蛋白在同一细胞中产生。

b、同一基因在不同细胞中产生出不同的蛋白质（在不同细胞中有不同的剪接方式），表现出组织特异性。

c、不同发育时期或不同条件下采取不同剪接方式，表达不同蛋白。

⑶RNA编辑：RNA水平上的碱基变异，导致编码改变。

⑷RNA再编码：RNA读码方式的变化，也会影响蛋白质的合成。

15. 举例说明mRNA前体剪切的意义和机制。

真核生物的结构基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子，但内含子序列下是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达，在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用。

mRNA前体中的内含子（intron)必须精确的剪切掉，剪切位置发生一个核苷酸的差异，即会导致阅读框（readingframe)的改变，从而合成非功能蛋白。

剪切位点特征：

a. 是保守序列，有共同的结构基元：5′AGGUAAGU。  b. 无互补。  c. 位于内含子和外显子交界处。

d. 以GU开始，以AG告终。

内含子的剪切机制：剪切由2个转酯反应完成（酵母）。

a. 分支点腺苷2′-OH 攻击5′外显子剪切位点，形成2′-5′磷酸二酯键，从而形成分支结构。

b. 上游外显子3′-OH 攻击内含子与外显子2（下游）之间的磷酸二酯键，使外显子1和外显子2联结。

c. 释放内含子环。  d. 整个反反应中磷酸二酯键数未变。

16  说明基因序列变异但功能未变的可能原因（同第14题）

16. 简述真核生物基因表达的不同层次。（同第2题）

真核生物的基因表达比原核生物更复杂和精细，也分为更多的层次。

（1）DNA和染色体水平的包括：基因扩增、基因重排、DNA修饰、基因封闭（染色体结构）。

（2）转录水平，是最重要的水平包括：转录起始、延伸的弱化、终止，都会对mRNA前体水平产生影响。

（3）转录后RNA前体加工及转运的：真核生物转录和翻译不偶联，转录出的mRNA前体经加工才能成熟为可作为翻译模板mRNA 。此过程包括剪切、拼接、编辑、5′- 和3′-端的修饰及转运到翻译场所等。

（4）翻译水平，包括核糖体的磷酸化/去磷酸化调节，poly(A)的调节，移码和通读等等。

（5）翻译后水平的：包括翻译产物剪切、修饰—如糖基化，磷酸化、切除信号肽、脂化及构象形成、转运和装配成复合蛋白等。

（6） mRNA 降解的：随生长发育及外界环境改变，细胞中蛋白质种类也在不断改变。原有mRNA要降解并以新mRNA代之。因此mRNA是有一定寿命的，细胞中有控制mRNA寿命的机制。

17. 从基因和蛋白质数量及互作说明真核生物基因表达的复杂性

18．真核基因启动子的结构特点，已知某一基因受热激表达，试设计一个实验克隆其启动子，并研究其结构。

⑴可以以cDNA为核心，有内切酶消化cDNA两侧序列，自身环化，设计何时的引物扩增cDNA旁侧序列，寻找启动子区。

⑵对启动子的研究，通常是将启动子连接到报告基因上，然后用缺失、突变、插入等手段研究改变后的启动子的活性变化，进而推知启动子上潜在的顺式元件。

19．人类基因组计划原预计人类至少可能有10万个基因，但全序列测定后发现仅有3万个，能否作出解释。

⑴DNA水平上有基因重排（如抗体基因重排）、基因扩增等现象存在，极大的丰富了基因的多样性。⑵在转录水平上，不同的启动子元件和不同的转录因子相互作用，形成模块化组合，使得人类可以用较少的基因表达丰富的时空、组织多样性。⑶转录后水平加工，包括mRNA的可变剪切、RNA编辑、RNA再编码等等，直接在RNA水平上发生变化，使得一个基因的产物可以多种多样。⑷翻译后加工，包括多肽的剪切、修饰等，可以使同一mRNA的翻译产物形成不同的功能分子。因此，人类可以用较少的基因表达出丰富的性状特征。

20．何谓可变剪切，举一例说明可变剪切的机理，设计一个实验，证明存在剪切位点。

⑴概念，基因产生的前体mRNA可以通过不同方式的剪切，产生2种或多种mRNA的现象。

⑵举例机制：A:加尾位点的选择，大鼠降钙素基因的前体mRNA有2个加尾位点，在甲状腺中选择第一个，在脑中选择第二个，产生不同的mRNA。B：选择不同的内含子/外显子模块进行组合，还举上例，在甲状腺中，成熟mRNA有第1,2,3,4外显子，而在脑中是第4,1,2,3,5,6外显子。C：选择不同的剪切位点，如SV40病毒早期转录有2个外显子1个内含子，可在内含子中的不同部位进行剪切，分别产生大、小t抗原。D：以上机制可能同时发生。

⑶实验：可以在小鼠不同组织中提取mRNA，分别与对应基因的DNA单链杂交，在电镜下观察，未结合的单链区即内含子区。比较不同组织中的mRNA－DNA杂交图，比较未配对的单链差异，即可变剪切的差异。

20．分子生物学与你所学专业有什么关系？请具体说明（略）

21．真核生物基因表达活性（效率）主要取决于哪些机制？试述基因转录的起始过程。

⑴机制：A:染色体水平上，组蛋白和DNA结合的紧密程度，DNA螺旋化的程度。B:有无上游元件，上游元件的种类数量，有无增强子等。C：对于诱导性启动子，必须有相应诱导物，才有可能使基因表达。D：核心启动元件的序列保守程度，突变或位置的改变都会明显的影响聚合酶的结合。

⑵过程：以有TATAbox的编码蛋白质的II型启动子为例：A:DNA与组蛋白形成较松散的构象，以利于各种酶和因子与DNA结合。B：若有上游元件或增强子或应答元件，则可与相应的转录因子（诱导因子）结合，以促进后续的过程。C：TFIID（包括TBP及其他亚基）与TATAbox结合。D：TFIIA与TFIID及TATAbox结合，起到稳定构象的作用。E：TFIIB结合，起到桥梁左右，连接TFIID与RNA聚合酶。F：TFIIF与聚合酶结合，并引导聚合酶与TFIID结合，TFIIF还有解旋酶的作用。G：TFIIE结合。H：TFIIH、J结合，TFIIH有激酶活性，是RNA聚合酶的CTD区磷酸化，导致聚合酶与转录因子分离。I：延伸开始。

22．为什么病毒侵染真核生物后期表达和致病有器官组织特异性？

⑴病毒外壳可与特定组织细胞表面配体相识别，并侵染特定的组织，从而使病毒一开始就具有组织特异性；？⑵有的病毒基因的表达需要组织特异的转录因子参与，否则无法表达。？