RT-PCR基本步骤

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

2．实时荧光定量PCR无需内标

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 

RT-PCR步骤

总RNA提取

1.取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。

2.震荡30s。

3.加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 

4.12000×g，4℃ 离心，15min。

5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6.加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7.12000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8.弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。

9.7500×g，4℃ 离心，10min。

10.弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5－10min。

11.沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280

12.计算浓度与纯度，－70℃保存。

　　　　　　　           OD260×40×稀释倍数

RNA浓度（μg/μl）＝────────────

                               1000

逆转录合成 cDNA

     反应体系如下

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  MgCl2                                               2μl

  10×RT Buffer                                        1μl

  RNase Free dH2O                                  3.75μl

 dNTP Mixture(各10mM)                                1μl

  RNase Inhibitor                                     0.25μl

  AMV Reverse Transcriptase                          0.5μl

  Random 9 mers                                      0.5μl

  Positive Control RNA  (1μg)                           1μl

混匀快速离心一次

反应条件如下

            30℃         10min

            42℃         30min

            99℃          5min 

             5℃          5min  

    -20℃ 冰箱冻存                        

 PCR反应

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 摸板cDNA                                  2.5μl

 5×PCR Buffer                               2.5μl

 灭菌蒸馏水                                   7.2μl

 聚合酶 Ex Taq HS                            0.1μl

 上游引物                                     0.1μl

 下游引物                                     0.1μl　

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　Total                                      12.5μl

混匀快速离心一次

反应条件

   94℃                        2min     1Cycle

   94℃                       40sec     ┓

   50-65℃                     40sec    ┃   25-35Cycles

   72℃                        1min     ┛

   72℃                         5min     1Cycle

          PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl　加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V 

 100mA  30min   溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果