还原酶活性测定

一、原理：还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它作用于NO3-使还原为NO2-；产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。NO2-含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。

二、仪器药品： 

721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角烧瓶、移液管、烧杯 

    0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5 

    0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。 

    磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 

    α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。 

    NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。 

    三、操作步骤 

    1、将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2到3次，吸干水分，然后于天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.2—0.3g（或每份取30个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，这520nm下进行比色测定。通过标准曲线测得NO2- 的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO2- μg或μmol表示之。

    注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加NO2- 的含量。

    2、绘制标准曲线 

    与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。 

    吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标绘制吸光度—浓度曲线。