溶菌酶的制备及其性质

【操作原理】 

溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数  为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。 

　　溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。

【操作流程】 

1.蛋清的制备 

将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml. 

2.鸡蛋清粗分离 

按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。 

3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 

⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。 

⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。 

⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。 

⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。 

⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。 

(6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。 

4.Sephadex G50分子筛柱层析 

⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。 

⑵ 上样。 

⑶ 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。 

⑷ 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。 

⑸ 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。 

蛋清提取溶菌酶技术

溶菌酶又称细胞壁质酶或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种国内外很紧销的生化物质，广泛应用于医学临床。具有多种药理作用，能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等，有抗菌的作用，常用于五官科多种粘膜炎症，皮肤带状疮疹等疾病。是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少

的工具酶。随着生物工程的发展，提取溶菌酶具有重要的意义。

一，生产方法

（1）收集鸡蛋清将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（最好是新生的鸡蛋、PH值不得低于8，否则不能使用），按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5min，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快、搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带块及碎蛋壳等。

（2）加入氯化钠  按每100ml蛋清溶液加入2g.氯化钠的比例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。

（3） 粗制溶菌酶  加完氯化钠细粉后， 再用1mol/L 的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的PH值调节到10.8。在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液PH值时，用胶头滴管将其逐渐滴入并不断搅拌以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量。为加速溶菌酶的结晶过程，可再加入适量的溶菌酶结晶体作为晶种。低温下静置数天，溶菌酶结晶将慢慢析出，于72~96h 达到最高产率。待结晶完全后，倾去上清液并用布氏漏斗滤出结晶，即可得到粗制的溶菌酶晶体。

（4）精制溶菌酶 将制得的粗结晶用PH值4.6的醋酸溶解，然后让酶液静置2h，接着过滤除去不溶物，收集滤液并量出体积，按100ml滤液加5g氯化钠的比例加入（加入方法与第二步加入氯化钠的方法相同）。然后用1mol/L的氢氧化钠溶液缓慢地将其PH值调节到10.8 后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用布氏漏斗过滤可得溶菌酶结晶，如纯度不够，可重复操作提纯，直至达到所需要的纯度为止，结晶于30~40°:烘干后即得溶菌酶产品。

（5）包装存贮  产品应装于玻璃或陶瓷容器中，置于阴冷处保存，以免溶菌酶受热后失去活性。

注意事项

（1）整个过程只能在玻璃或陶瓷容器中进行，不可用金属容器，以免酶失活而影响产品的得率及质量。

（2）操作的全过程要在低温下进行（10°以下），防止原料变质和酶失活。

（3）第三步中加入溶菌酶晶种的具体操作是将溶菌酶晶体均匀地悬浮于少量的PH值为10.8，浓度为5%氯化钠溶液中，取几滴加入到调好的PH值和氯化钠浓度的蛋清液内，再置低温处结晶。

SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量 

原理

SDS 是一种阴离子表面激活剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原； SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS- 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 -SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 M r 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 M r 的函数。SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质，以相对迁移率（mR）为横坐标，相对分子量（Mr）的对数值为纵坐标。在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线，然后根据未知蛋白的迁移率，在半

对数坐标上查出其对应的分子量。

注意事项

1．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水。

2．样品液在加样前需在沸水中加热几分钟。

3．电泳时，电流不可太大，太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行，以便于散热。