细胞划痕实验详细步骤及说明

　　它参与到很多生理和病理的活动中，如下： 

　　免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一; 

　　炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症部位并发挥其吞噬和组织损伤作用; 

　　肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后随脉管系统实现远处转移; 

　　损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参与消炎和凝血; 

　　胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的正常发育。

　　细胞划痕实验的基本原理： 

　　在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验(Wound-Healing Assay)，广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。 

　　细胞划痕实验过程： 

　　在体外提升皿或平板提升的单层贴壁细胞上，用微量头或其它硬物在细胞生长的区域划线，去除部分的细胞，然后再继续提升细胞至实验设定的时间(可有不同时间点)，取出细胞提升板，显微镜下观察周边细胞是否迁至划痕区，并拍照。 

　　具体实验步骤： 

　　1. 提升板划线标记 

　　用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着)，每孔至少穿过5条线，每条线均匀且平行。 

　　2. 细胞铺板 

　　在孔内接种约5-10*105个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量)，原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀(细胞铺板均匀技巧可参考往期内容)。 

　　3. 细胞划线 

　　第二天用20uL头(灭菌)或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。 

　　Tips： 

　　减少划痕距离的误差办法—— 

　　●不同孔之间最好使用同一只头或牙签; 

　　●头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺; 

　　●最好保持力度一致，尽量一次性划完。

　　4. 洗细胞，去除划下的细胞 

　　划线完成后，使用无菌PBS洗细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清(<2%)的提升基。 

　　Tips： 

　　●在用PBS缓冲液冲洗时，注重贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞; 

　　●为了避免细胞数量和状态受到影响，尽量不要用吸泵，可用移液缓慢吸走。

　　5. 细胞提升与观察 

　　将细胞放入37℃，5%CO2提升箱中提升。然后在适当的时间点，如0，6，12，24小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。

　　6. 数据分析

　　使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至8 条水平线，计算细胞间距离的均值。

　　注重事项 

　　1，划痕实验一般选择6孔板?因为6孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察;当然若是需要高通量初筛时，也可以用12或者24孔板。 

　　2，细胞的接种密度原则一般是过夜为100%融合，若过夜后细胞未100%融合，虽可以适当延长提升时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。 

　　3，降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法： 

　　① 使用无血清或低血清提升基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响; ② 一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理1h，抑制细胞的。 

　　4，确保拍照的观察点固定：按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，划痕一次与5条定位线相交，就有10个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。