如何测量RNA的纯度和含量

【原理】

使用光密度测定法测量其浓度，RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260，再推算出其浓度。使用DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和A280值。根据A260/ A280比值，估测RNA质量。一般A260/ A280比值在1.8-2.0之间，可以满足实验要求。在100µl RNA原液中取1μl稀释至250μl（DEPC处理的水），测定样品的A260和A280的值，按下列公式计算其浓度：RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（n g/μl）

【仪器】

分光光度计(紫外可见光两用)。

【试剂】

水、RNA溶液

【方法步骤】

◆测定 RNA浓度按以下步骤进行操作： 

⑴ 在10μl的RNA原液取1μl ，放在0.5ml EP管中，加入249μl dd H2O，用移液反复混匀。

⑵ 用dd H2O为空白对照，调节A260零点。

⑶ 倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A260值。倒掉比色杯中的RNA样液，用dd H2O冲洗比色杯，再调节A280零点。

⑷ 倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A280值。计算A260/ A280比值，比值≥1.8，满足实验要求。

⑸ RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（n g/μl）

◆测定 RNA纯度按以下步骤进行操作：

(1)取4ulRNA样品加水到1ml。

(2)用1ml水做空白。

(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。

(4)每µl中RNA浓度(ug)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原RNA样品浓度为2ug／µl。

(5)再测一次280nm处OD值，计算二者的比率，若比率接近2，则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，再用酚／氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。

(6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质，那么还要测定一次230nm处OD值。