酶联免疫法测定全血他克莫司浓度

3通讯作者

文章编号:1007-4287(2006)07-0806-02

酶联免疫法测定全血他克莫司浓度

赵　虹1,孙大军13,荣墨克1,郎志刚2

(1.吉林大学中日联谊医院吉林长春130033;2.长春博泰医药生物技术有限责任公司吉林长春130012)

摘要:目的　酶联免疫法(E LIS A )测定全血他克莫司浓度的方法学确证。方法　含有他克莫司的全血样本经消化、孵育、离心,上清加入已包被的酶标板进行抗原抗体反应,检测波长450/630nm 。结果　方法的平均回收率为

93.5%,批内批间变异系数7.6%和9.8%,检测范围30μg/L 以内,稀释线性回收率95.0%-101.4%。结论　该方法

快速、敏感、准确,适用于测定全血他克莫司浓度。

关键词:酶联免疫法;他克莫司;血药浓度中图分类号:R446161

文献标识码:A

Measurement of tacrolimus concentration in whole 2blood specimens by E LISA 　ZH AO Hong 1,SUN Da 2jun 1,RONG Mo 2ke 1,et al.(11China 2Japan Union Hospital o f Jilin Univer sity ,Changchun 130033,China ;2.Changchun BoTai Medicine BioTechnology Co ,Ltd.Changchun 130012,China )

Abstract :Objective 　T o evaluate the accuracy of tacrolimus concentration in whole 2blood specimens by enzyme linked im 2munos orbent assay (E LIS A ).Methods 　The specimen was treated by using digest ,incubation ,then centrifuged.The supernatant was added to polystyrene microtiter wells that have been precoated.Abs orbance was read at 450/630nm.R esults 　The recovery of the method was a mean of 93.5%.The within 2run C V was 7.6%.The between 2run C V was 9.8%.The linearity was up to 30μg/L.The diluent linear recovery was linear from 95.0%-101.4%.Conclusion 　This method was rapid ,sensitivity and accurate for the anal 2ysis of tacrolimus concentrations in whole 2blood specimens.

K ey w ords :E LIS A ;tacrolimus ;blood drug level

(Chin J Lab Diagn ,2006,10:806)

　　他克莫司(tacrolimus ,FK 506,商品名普乐可复

prograf )是日本藤泽药品工业公司从筑波链霉菌(streptomyces tssukubaensis )的发酵液中提取的一种23元环大环内酯类免疫抑制剂[1]。体外实验证实其免疫活性是环孢素的50-100倍,临床可有效预防各种器官移植后急性排斥反应的发生,并能逆转难治性排斥[2]。由于该药用药剂量小,安全范围窄,因此测定个体血药浓度以调整剂量在临床上有着至关重要的意义。本文采用酶联免疫法(enzyme linked immunos orbent assay ,E LIS A )检测FK 506全血浓度,并评价该方法的准确性及可行性,旨在为临床合理用药提供依据。1　材料与方法1.1　仪器与试剂

美国索林E LX 2800酶标仪,水平振荡器,GI LS ON 定量移液器,恒温水箱,旋涡混合器,自动平衡离心机,微量离心管,双蒸水,美国DiaS orin 公司PRO 2T racT M ‖T acrolimus E LIS A 试剂盒。1.2　方法

1.2.1　血样采集　接受FK 506治疗患者用药至少3

日,采血前空腹并适当控制饮水量,避免使用与

FK 506有相互作用的药物。于给药后12小时(谷浓度)采取肘静脉肝素抗凝血2毫升,轻摇混匀,于采血当日测定FK 506血药浓度。1.2.2　血药浓度测定　采用ELIS A 法测定全血中FK 506浓度,具体操作方法依试剂说明书,5min 内读板,测定波长450/630nm ,E LX 2800型酶标仪内置测定FK 506测试软件,通过吸光度值仪器自动生成标准曲线并给出各样本浓度,浓度单位μg/L 。1.2.3　统计学方法　试验数据以均数加减1个标准差表示( x ±s ),显著性检验应用配对t 检验。2　结果

2.1　精确性试验　选择高(30.0μg/L )、中(15.0μg/L )、低(1.0μg/L )3个浓度平行8次、测定14天,计算得批内批间变异系数为7.6%和9.8%。2.2　准确性试验　取已知FK 506浓度的临床全血样本,平行7份,其中6份分别加入0,0.3,1.0,

3.0,10.0,30.0μg/L6个浓度的标准品,按血药浓度方法测定,计算平均回收率为93.5%。2.3　稀释线性试验　分别将2份高浓度标准全血样

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608—Chin J Lab Diagn ,July ,2006,V ol 10,N o.7

2.4　干扰试验　与tacrolimus代谢物存在交叉免疫反应,蛋白质或胆红素水平升高会影响样品结果。

2.5　取样量试验　试剂盒配有一瓶消化剂,按正常取样50μl用量不足,考虑等比例降低样本和消化剂的用量,按方法项操作,结果见表1。

表1　取样量与测定值误差的关系( x±s)

取样量(μl)n

测定值(μg/L)

预测值实测值

测定值(μg/L)

预测值实测值

测定值(μg/L)

预测值实测值

50　　29.8±1.353　　9.7±0.353　　3.1±0.32

40 30630

29.3±1.253

27.1±0.9833

10

10.1±0.463

9.1±0.5133

3

2.9±0.313

2.7±0.2533

2024.6±1.153338.3±0.32333 2.2±0.21333　　与预测值比较:3P>0.05,33P<0.05,333P<0.001

2.6　样品稳定性测试　标准品、质控品及不能即时

检测的样本需冷冻保存,检测时室温融解,进行冻融

条件下的稳定性考察,结果见表2。

表2　冻融试验结果(n=6)

浓度(μg/L)

实测值(μg/L)

冷冻前冻融一次冻融二次

　　1.0　0.9±0.1　1.1±0.2　1.2±0.2

10.09.7±1.212.3±1.911.9±2.1

25.023.6±2.028.6±1.529.1±1.3

2.7　血药浓度监测　对口服FK506的肝、肾移植等患者的1534份全血样本应用E LIS A法进行检测,其全血稳态保浓度术后第1个月多分布于11-15μg/ L,第2-3个月多分布于8-11μg/L,第3-12个月多分布于5-8μg/L,一年后控制于3-5μg/L。

3　讨论

FK506在国外应用已有数年历史,免疫抑制机制与环孢素A相似,作为环孢素A长期使用后出现严重肝毒性的替代药物,其主要副作用是血糖升高、肾毒性和神经系统毒性,且经常合并应用的药物,如霉酚酸酯、洛赛克、氟康唑、硝苯地平、钙通道阻滞剂等都与之有药物相互作用,监测血药浓度是有效治疗并及时发现和延缓毒副作用的必需手段。目前检测FK506血药浓度的方法有①微粒子捕捉酶免疫发光法(MEI A)②酶联免疫法(E LIS A)③高效液相色谱2质谱联用法(HP LC2MS)[3]。其中HP LC法早已应用于环孢素A浓度的监测,该方法的优势和性也有明确的论述[4]。MEI A和E LIS A法均为免疫分析法,同样存在交叉免疫反应,而MEI A法的仪器和试剂的成本较高。本文应用E LIS A法测定了全血FK506浓度,批内、批间变异系数7.6%和9.8%,方法平均回收率93.5%,提示该法具有较好的准确度和精密度,其价格低廉、快速敏感的优势适宜在临床广泛应用。

作者简介:赵虹,女,学士。主要从事药物研究及临床血药浓度监测工作。

参考文献:

[1]陆志城.他克莫司的药物相互作用[M].国外医学泌尿系统分册,

2001,21(5):239-242.

[2]徐新军,刘皋林,邓渝林,等1新型强效免疫抑制剂他克莫司在健

康中国人体的药代动力学[J].中国抗生素杂志,2002,27(1):59. [3]张　戈,王志玉,王兆清,等.他克莫司血药浓度监测方法的比较

[J].中国药学杂志,2003,38(5):386.

[4]赵　虹,荣墨克,郎志刚,等.固相萃取反相高效液相色谱法测定

全血环孢素A[J].中国实验诊断学,2004,8(5):523.

(收稿日期:2005-08-10)

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中国实验诊断学　2006年7月　第10卷　第7期