MDA、SOD含量测定

SOD活性测定(避光！)

【实验用品和仪器】

手套、称量纸、电子天平、250ml烧杯*1、500ml烧杯*1、100ml烧杯*2、50ml烧杯*6、玻棒*10、胶头滴管*4、200ml量筒*1、100ml量筒*1、1000ml容量瓶*3、100ml容量瓶*3，200ml棕色容量瓶*1、150ml容量瓶*1、恒温水浴锅、研钵*n、离心管*3n、10ml带塞试管*（n+1）、瓷盘、黑色塑料袋、黑色硬纸套、离心机、人工气候箱、分光光度计、比色杯*4、5ml移液、1ml移液、头、镊子、废液缸、和10ml小烧杯*（n+7）（n表示要做的样品数，x表示分X组比色）

【实验药品】液氮、冰、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、EDTA-Na2、核黄素、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）和去离子水

【配制试剂】

①50 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液（PBS）（含0.1mmol/L EDTA）。

（1） 磷酸缓冲液（母液）配制：

磷酸A：0.2M  Na2HPO4·12H2O：  71.g 加水1000ml；

             磷酸B：0.2M  NaH2PO4·2H2O： 31.21g 加水1000ml。

（2）磷酸A 228.75ml + 磷酸B 21.25 ml，加入EDTA-Na2 0.0372g；加水定容至1000ml。

②220 mmol/L甲硫氨酸：称甲硫氨酸3.2824g，用50 mmol/L pH7.8 PBS溶解定容至100ml（现用现配）。

③1.25mmol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）：称NBT 0.1022g，用50 mmol/L pH7.8 PBS溶解定容至100ml避光保存。（现配现用）（称取时NBT的重量在0.102g-0.1025g之间均可，最好0.1022g）

⑤0.033 mmol/L核黄素：称0.00252 g用PBS溶解定容至200ml。（称取时核黄素的重量在0.0025g-0.0026g之间均可，最好0.0025g）低温避光保存，即用黑纸将装有该溶液的棕色瓶包好，三天内有效。（现配现用）

【SOD提取】

（1）将鲜叶剪碎混匀，称取0.5g（3份），放在研钵中，先用液氮研磨叶片，磨碎后加2 ml PH7.8的PBS，研磨后转移进离心管，加2+1ml清洗研钵。

（2）4 ℃下10000 r/min离心15min，上清液为样品提取液。放在冰上避光保存。

【SOD 活性测定】

1取5ml或10ml小烧杯 N+6只，N表示测定样品数，另外6只为对照，其中CK（小烧杯放在大托盘中，盘里放冰）：一个黑暗（空白对照）；一个照光；（为保证测定，黑暗和照光都3个重复比较好）（不加酶液，以缓冲液代替）

2按照下表加入各溶液（加试剂前确认关灯，过程必须避光，在使用核黄素前必须避光）

4反应结束后，用黑布罩遮盖小烧杯终止反应，以0-暗对照管做空白，在560nm处测定吸光度值。

【计算】

SOD活性=〔（ACK-AE）*V/ACK〕*0.5*W*Vt

ACK：照光CK吸收值

AE：样品管吸收值

V：样液总体积

W：样品鲜重

Vt:测定时样品用量

SOD比活力=SOD总活力/蛋白质含量

蛋白质含量单位为mg/g

MDA含量测定(避光！)

【配制试剂】

150 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液（PBS）

②20%三氯乙酸（TCA）：称20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至100ml。

可称30g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至150ml。

③0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称0.5g硫代巴比妥酸，用20%TCA溶解并定容至100ml。

【MDA的提取】

同SOD

【MDA含量的测定】

取上清液1.5 ml于10ml带塞试管中（对照管以1.5 ml蒸馏水代替提取液还是PH7.8PBS），加入0.5% TBA 2.5 ml，混合后于沸水浴上反应20min，迅速冷却后在3000 r/min下离心15 min，上清液分别于450 nm、532 nm和600 nm波长处测定吸光度值。

【计算】

MDA浓度C（μmol/L）=6.45（OD532- OD600）-0.56 OD450