C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展

许崇波

(大连大学生物工程学院,辽宁大连116622)3

摘　要:C 型产气荚膜梭菌是引起仔猪肠毒血症的主要病原菌之一,其致病因子是菌体产生的α、

β毒素.作者就α毒素的检测方法、基因克隆与表达、结构与功能以及β毒素的分子生物学研究进展进行了介绍.

关键词:C 型产气荚膜梭菌;致病因子;研究进展

中图分类号:Q78　　　文献标识码:A 　　　文章编号:100822395(2006)022*******

Research progress on m olecul ar b i ology of pa thogen i c factor of C lostridium perfringens type C

XU Chong 2bo

(College of B i oengineering,Dalian University,Dalian 116622,China )

Abstract:C lostrid ium perfringens type C is the most pathogenic bacteriu m,which can lead t o enter ot oxae m ia of

p iglets .Its pathogenic fact or is al pha 2t oxin and beta 2t oxin .Detecti on methods,gene cl oning and exp ressi on regula 2

ti on,relati onshi p bet w een structure and functi on of al pha 2t oxin and molecular bi ol ogy of beta 2t oxin were intr oduced

in this article .

Key words:C lostrid ium perfringens type C;pathogenic fact or;research p r ogress

产气荚膜梭菌(C lostrid ium perf ringens )是引起多种动物坏死性肠炎和肠毒血症的主要病原菌,分为A 、B 、C 、D 、E 5个菌型,其致病因子主要是菌体产生的外毒素,其中β毒素是由C 型产气荚膜梭菌产

生的一种坏死性和致死性毒素[1].长期以来一直认为C 型产气荚膜梭菌产生α毒素和β毒素(现称为

β1毒素),而且是主要的毒力因子.然而,直至1997年才确定该菌还可以产生另外一种β毒素(现称为β2毒素)是更重要的毒力因子.业已证实,β1毒素与β2毒素具有相似的生物学活性,但没有明显的基因序列和氨基酸序列的同源性,且分离峰也不同

[2].近年来,对α、

β1、β2毒素的研究取得了很大进展,现将有关情况综述如下.1　

α毒素α毒素是C 型产气荚膜梭菌主要的毒力因子之一,它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性.α毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽,分子量约为43k D.它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶,具有磷脂酶C (Phos pholi pase C,P LC )和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase )两种酶活性,能同时水解磷脂酰胆碱(Phos phatidylcholine )和鞘磷脂(Sphingomye 2lin ).α毒素依靠这两种酶活性,水解组成细胞膜的主要成分—膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完整性,

导致细胞裂解[1].

1.1　

α毒素的检测检测α毒素的经典方法包括动物致死性试验、毒素中和试验、卵磷脂水解试验等多种方法,其中以3收稿日期:2005211205

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30360080)

作者简介:许崇波(1968-),男,教授,生物学博士,主要研究方向:基因工程及分子生物学1

毒素中和试验最为特异,但这些方法均费时费力,敏感性较低.随着生物技术的不断发展,一些新的技术在α毒素的检测中得到了广泛的应用.

Hale等[2]提出了一种测定α毒素的捕获抗体EL I S A方法,该法能准确而特异性地定量测定产气荚膜梭菌所产生的α毒素,其检测极限可低达19ng/m l,因而用这种方法检测α毒素比磷脂酶C活性测定和小鼠致死性测定等技术更敏感.

Fach等[3]首先报道了应用聚合酶链反应(PCR)检测α毒素.通过对α毒素基因与腊样芽孢杆菌、双酶梭菌和绿脓杆菌的磷脂酶C基因的比较,设计了四对针对α毒素基因的特异性引物,然后按标准的PCR方法扩增出了425bp、3bp、319bp和283bp的DNA片段,经比较扩增的DNA片段与引物在α毒素基因内的位置完全一致,经性内切酶EcoRV对扩增的片段分析证明,所扩增的片段是α毒素的特异性基因片段,应用这些引物未从腊样芽孢杆菌、绿脓杆菌、索氏梭菌和双酶梭菌中扩增出DNA 片段.以DNA作为模板时,其检出的极限可达250ng～25fg,且在扩增后的2h内即可获得结果.此方法还可对粪便样品中的细菌进行检测,其敏感度可达2195×108菌/g.当用套式PCR检测时,对细菌的检测极限更可低至1～6个细菌.

1.2　α毒素的基因克隆与表达

α毒素基因位于染色体上,其结构基因大小为1194bp,编码398个氨基酸,分子量为45480D,信号肽为28个氨基酸,成熟肽为370个氨基酸,分子量42580D,与实验测得的天然或克隆的α毒素分子量(43300)一致.α毒素编码区G+C含量为34%,S D序列为CGGGGG,-10区序列为T AT AAT,-35区序列为GTG AGG,终止密码子为2个连在一起的T AA.Kataya ma等[4]比较了C型和A型产气荚膜梭菌α毒素基因的核苷酸序列,结果C型菌株α毒素结构基因与A型菌株α毒素结构基因比较,有18个碱基序列不同,导致编码的6个氨基酸不同.另外,A型菌株的-35区序列为GTG AGC,其它部分相同.虽然C型菌株α毒素成熟肽与A型菌株α毒素成熟肽有4个氨基酸不同,但却具有相同的磷脂酶C活性和溶血活性.Tsutsui等[5]比较了5株A型菌株(NCT C8237、KZ211、P B6K、13和8-6)、1株B型菌株(NC I B10691)、1株C型菌株(NC I B10662)、2株D型菌株(L9和NC I B10663)和1株E型菌株(NC I B 10748)α毒素的核苷酸序列及编码的氨基酸序列,在1194bp编码区里,不同菌株之间平均有1.3%的核苷酸序列不同,有112%的氨基酸序列不同,但并不影响α毒素本身的活性,各型菌株产生的α毒素具有相同的特异性.

α毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别,因而α毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达,也可在大肠杆菌中得到高效表达.此外,也可将其置于其它启动子下,转化大肠杆菌后获得高效表达.许崇波等[6]将α毒素基因置于大肠杆表达载体pET-28b中T7启动子下,获得了高效表达,经S DS—P AGE和薄层凝胶扫描分析,I PTG诱导4～5h后的BL21(DE3)(pETXA1)表达的α毒素占菌体总蛋白16128%.T oyonaga等[7]研究还证实α毒素的产量是在转录水平上的,他们将启动子-35区上游富含A+T序列缺失017kb,结果α毒素的表达量增加10倍,表明该区在基因表达时呈负作用.核苷酸序列分析证明,在α毒素基因上游-66至-40间存在三个周期性重复的(d A)5-6序列,当缺失含二个(dA)5-6区的77bp片段时,α毒素表达量异常增加,这些实验结果充分说明了α毒素启动子上游的基因序列对α毒素基因的转录呈现负作用,这种作用可能是由于该区DNA扭曲的潜在影响.

1.3　α毒素的结构和功能

Titball等[8]对α毒素的结构和功能进行了研究,他们构建了一个截短的α毒素CP A1-249,能编码与PC-P LC同源的那部分毒素,结果CP A1-249依然保留了磷脂酶C活性,能水解磷脂酰胆碱,但却失去了α毒素的鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性,这表明α毒素N端可能具有溶血活性和致死性.随后,Titball等[9]又构建了α毒素C端CP A247-370,结果它不具有鞘磷脂酶活性、溶血性和致死性.然而当用CP A1-249和CP A247-370共同作用于小鼠红细胞时,却能使小鼠红细胞发生溶血,这表明C端能将溶血活性赋予N端,但也不能否认,CP A247-370结合CP A1-249后相互作用时,CP A247-370构象发生变化,从而激活CP A247-370的活性位点,使其具有了酶活性.W illia m s on等[10]又对CP A1-249和

　第2期许崇波:C 型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展3　CP A247-370进行了免疫原性研究,结果CP A1-249免疫小鼠后产生的抗体能中和α毒素的磷脂酶C 活性,但不能中和α毒素的溶血活性.CP A247-370免疫小鼠后产生的抗体既能中和α毒素的磷脂酶C 活性,又能中和α毒素的溶血活性,同时能抵抗致死量α毒素的攻击和至少10LD 100剂量的A 型产气荚膜梭菌攻击.上述这些试验结果说明,α毒素可能由2个功能区组成,氨基端具有磷脂酶C 活性,羧基端具有鞘磷脂酶活性,而且只有两者协同作用,才具有溶血活性和致死活性.但尚不清楚这种α毒素是存在2个活性位点,还是单一活性位点.单独α毒素氨基端CP A1-249和羧基端CP A247-370的毒性很低,但其免疫小鼠后产生的抗血清中和效果不同,这可能是由于CP A247-370在单独表达后,形成的高级结构与α全毒素完整结构相似,故能中和α毒素的溶血活性和致死活性,表明α毒素的保护性抗原为其C 端.如果是后者,羧基端在酶活性方面将起着重要作用.

α毒素的氨基酸组成对其生物活性和毒性有着重要的影响,其中一些氨基酸是对其生物活性起着

十分重要的保守氨基酸.Nagaha ma [11]利用位点突变技术,研究了组氨酸残基在α毒素中的作用,他们将

第68位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,结果突变的α毒素完全丧失了α毒素本身的磷脂酶C 活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性.如果将第126位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,将第136位组氨酸残基突变成甘氨酸残基或丙氨酸残基,结果突变的α毒素活性比天然α毒素活性下降100倍.如果将第46、207、212、241位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,结果突变的α毒素活性和天然α毒素活性相比没有什么变化,这表明上述4个位置的组氨酸残基对α毒素具有生物活性不是必需的.随后他们将56位的天门冬氨酸突变成丝氨酸、天门冬酰氨、谷氨酸或谷氨酰氨之后,突变的毒素完全丧失α毒素的溶血、磷脂酶C 和鞘磷脂酶活性.当130位的天门冬酰氨发生突变后,突变毒素与天然毒素相比其活性降低了约100倍,同时还证明,56位的天门冬酰氨对毒素的酶催化作用是必需,而130位天门冬酰氨对其结构的维持是必需的[12]

.尽管上述不同位点的氨基酸发生突变之后,对毒素的生物活性有着不同程度的影响,甚至可使其生物活性完全丧失,但仍然保持着天然毒素的部分或全部抗原性.

1.4　抗α毒素单链抗体的特性

许崇波等[13217]用提取的A 型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫BALB /c 小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/

0骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接EL I S A 筛选,获得2株稳定分泌单克隆抗体(mAb )的杂交瘤细胞株,命名为1A8和2E3.经鉴定,mAb 1A8和2E3的I g 亚类为I gG3.细胞培养上清和腹水抗体效价分

别为1∶1024和1∶108.尤为重要的是,1A8和2E3杂交瘤细胞株分泌的mAb 不仅能够中和α毒素的磷

脂酶C 活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用.随后应用RT -PCR 技术,从杂交瘤细胞株1A8和2E3中,扩增出抗体V H 和V L 基因,分别克隆至pGE M -T 载体中.经核苷酸序列分析证实,ScFv -2E3基因全长为726bp,V H 基因大小为357bp,编码119氨基酸残基;V L 基因大小为324bp,编码108个氨基酸残基.ScFv -1A8基因全长为729bp,V H 基因大小为351bp ,编码117个氨基酸残基;V L 基因大小为333bp,编码111个氨基酸残基.经计算机分析,V H 和V L 基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征.将两种含抗α毒素单链抗体基因的质粒pXScFv -2E3和pXScFv -1A8用性内切酶Not 和Sfi 双酶切,经115%琼脂糖凝胶电泳分离,采用W izard PCR Prep s DNA Purificati on Syste m 回收0175Kb 的ScFv 基因产物.再将载体pUC 119载体用Not 和Sfi 双酶切,然后将处理好的pUC 119与0175Kb 的ScFv 基因片段通过T 4连接酶进行粘性末端连接后,转化至受体菌J M105中,得到重组质粒pUC2E3和pUC1A8,经酶切鉴定后进行诱导表达.以上述回收的ScFv 基因片段为模板,经PCR 扩增后引入Nco I 和Ba mH I 酶切位点,经Nco I 和Ba mH I 双酶切后回收ScFv 基因片段,然后将其分别与经Nco I 和Ba mH I 双酶切后回收的pHOG21和pET20b 连接,分别转化至受体菌J M 109和BL 21(DE3)中,得到重组质粒pHOG2E3、pHOG1A8、pET2E3和pET1A8,经Nco I 和Ba mH I 双酶切和核苷酸序列分析后,进行诱导表达,经EL I S A 检测表明:经I PTG 诱导后所表达的目的蛋白ScFv 存在于含分泌型表达载体pUC2E3和pUC1A8及pHOG2E3和pHOG1A8的大肠杆菌培养上清中,而在含pET2E3和pET1A8重组质粒的菌胞周质中检测到了ScFv 的存在,经S DS -P AGE 和薄层扫描分析表明,表达的ScFv 占含pET20b 重组质粒菌体可溶性蛋白的019%,占菌体沉淀的017%,其分子量约为2.6k D,且表达的ScFv 蛋白具有中和α毒素磷脂酶C 的活性.这种单链抗体的研制为将来

4　大连大学学报第27卷临床上治疗α毒素的中毒提供了一条新的途径.

2　β1毒素

β1毒素是一种强毒素,具有细胞毒性、致死性.纯化的β1毒素分子量为34kD 左右,等电点(P I )约为516.β1毒素对小鼠和豚鼠具有致死作用,对成年小鼠的最小致死量为2ng,腹腔注射的LD 50约

为415g/kg .Hunter 等[18]首先克隆了β1毒素基因,大小为110kb,分子量为34kD.β1毒素的ORF 位于

333～1340位之间,成熟β1毒素的N 末端氨基酸序列显示出信号肽序列的典型特征,该信号肽可以指导β1毒素穿过细胞膜分泌到细胞外.β1毒素的二级结构中β折叠占48%,N 末端第80～102位及146～148位氨基酸及C 末端281～290位的氨基酸是亲水性的,属于表位结构,第159～167位氨基酸是疏水性和隐蔽的.β1毒素的C 末端是疏水性的,可以形成一个跨膜区.Steinthorsdottir 等[19]

应用顺序PCR 对β1毒素的编码基因中的不同位点有关碱基进行定点突变,分析相关氨基酸的改变对于β1毒素生物活性的影响.结果表明:265位的唯一半胱氨酸残基被丝氨酸取代后并不影响β1毒素的生物活性,说明半胱氨酸的存在并不是β1毒素生物学活性所必需的.氧化因子使β1毒素失活的原因可能是由于其对半胱氨酸残基进行了修饰,而半胱氨酸本身在β1毒素的生物活性中并不起关键作用.212位的精氨酸残基用谷氨酰胺取代后,β1毒素活性降低515倍;用谷氨酸取代后,β1毒素活性降低12倍,说明212位的精氨酸对于维持β1毒素的生物学活性具有重要作用.203位的酪氨酸被苯丙氨酸取代后,突变蛋白对小鼠的LD 50增加215倍.由此提示:精氨酸和酪氨酸对于β1毒素的生物活性有重要意义.他们还将从C 型产气荚膜梭菌中克隆的β1毒素基因与谷胱甘肽S 转移酶基因融合,成功地表达出了相应的融合蛋白,该表达产物免疫小鼠后,可诱发机体产生中和抗体.3　β2毒素

β2毒素是一种强毒素,具有细胞毒性和致死性,它对小鼠静脉注射的最小致死量为3g .纯化的β2毒素分子量28k D ,等电点(P I )为514-515.此外β2毒素对中国仓鼠卵巢细胞(CHO )、小肠粘膜上皮细

胞(I 407)具有很强的细胞毒性,但是这种作用略低于β1毒素.Gibert [20]等首先从来自仔猪坏死性肠炎

病例的培养上清中分离纯化到β2毒素,并克隆了β2毒素基因,β2毒素的ORF 位于267～1065位之间,在β2毒素基因起始密码子ATG 的上游7个核苷酸处为由5个连续的G (GGGGG )组成的核糖体结合位点(RBS ),在β2毒素基因的3′端有一段能形成发卡环结构的反向重复序列,构成一个不依赖ρ因子的转录终止子.β2基因产物编码265个氨基酸,其中N 末端的30个残基构成疏水性区域(6～26位残基),形成一跨膜区,这30个氨基酸为信号肽序列.成熟蛋白起自31位的赖氨酸(Lys )共编码235个氨基酸.β2毒素基因与β1毒素基因或其它已知的产气荚膜梭菌基因序列没有明显的同源性.免疫学实验表明,抗β2毒素的抗体能识别纯化的β2毒素,并能与β1毒素发生弱反应.相反,抗β1毒素的抗体只能与β1毒素反应,而不能与β2毒素发生反应,表明β1毒素与β2毒素的免疫相关性较差,其机理尚不清楚.4　结束语

C 型产气荚膜梭菌属腐生性厌氧芽胞致病菌,在土壤中广泛存在,享有广泛的疫源地,因而对我国畜牧业生产构成严重威胁,全国各地仔猪红痢的发病率呈上升趋势,具有很高的发病率和死亡率,然而

本病的主要致病因子为菌体产生的α、

β1、β2毒素.我们在克隆α、β1、β2毒素抗原基因基础上[6,21222],进一步构建了α-β1和β1-β2融合基因[23224],这2种融合基因在含T 7启动子载体pET -28c 的宿主菌

BL21(DE3)中得到了较高水平表达,而且构建的重组菌株BL21(DE3)(pET XAB1)和BL21(DE3)(pET XB1B2)已经丧失了这3种毒素本身的毒性,同时具有较好的免疫保护性,这为下一步研制预防仔

　第2期许崇波:C型产气荚膜梭菌致病因子分子生物学研究进展5猪红痢多价基因工程亚单位苗提供了理想基因工程菌株.

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