高产淀粉酶菌株的筛选

一：前言

1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。

关键词：产淀粉酶、 芽孢杆菌、酶活力、筛选 

1. α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 

二、 实验材料： 接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱 载玻片 可见分光光度计 显微镜 紫外操作台

实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液 、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液

培养基配制： 牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉

三：实验步骤

1培养基的制备及其仪器的灭菌

（1）按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于50mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉放入烧杯中。加水到250mL熔解,并做好标记,再加入琼脂加热溶化,溶解2h，最后补充水到标记处，装入三角烧瓶内，加塞包扎。

（2）试管中加入9ml水，2个锥形瓶中加入150mL水，将所有待灭菌仪器和培养基用报纸包扎，121℃，30分钟高压蒸汽灭菌。 

（3）倒平板

将灭菌的培养基冷至50℃左右，三角瓶中的培养基倒平板，并贴上标签，静置待用。

2 产淀粉酶菌株的分离、纯化

（1）采集土壤样本

取离地面5-15cm处的土样10g

（2）稀释

称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，至于摇床摇1小时，使土样和水充分混合，使细胞分散。用一只无菌吸管吸取1ml土壤悬浮液加入盛有9ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的土壤溶液。

（3）初步筛选

用稀释样品的不同吸管分别依次从10-6、10-5、10-4、10-3样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上，用涂布棒涂抹均匀。倒置于37℃温箱中培养24小时。

培养24小时后，取出平板，注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的单菌落，用接种环沾取少量菌株采用四区域划分法。

（4）取长势好的菌株重复筛选3次

（5）将筛选所得单菌落进行革兰氏染色观察其形态涂片、干燥及固定

初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。 

镜检：油镜观察染色结果。

（6）酶活力测定

接种环沾取少许菌株于装有5ml无菌水的试管中，充分振摇，倒入离心试管中，4000 r / min离心30min,取3支试管，标明BO,B及U（BO：空白管，B：对照管，U：待测管），分别加入0.4g/ml淀粉缓冲液1ml，U管中加入离心所得的上清液100ul，BO管中加入蒸馏水100ul。混匀后放入37℃水浴箱准时水浴7.5min，取出加入碘应用液1ml摇匀，此时B管中加入上清液100ul。各管再加蒸馏水摇匀，660nm的波长下测吸光度。

    酶活力计算：    U＝（AB-AU）×80

                    ABO

（1）移液管吸取0.2ml菌悬液于12个平板上，用涂布棒涂抹均匀，分别紫外光照突变30s、1min、3min、5min(各时间梯度3个平板)，倒置于37℃温箱中培养24小时。

（2）将上述单菌落进行革兰氏染色观察其形态 

涂片、干燥及固定

初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。 

镜检：油镜观察染色结果。

（3）酶活力测定

接种环沾取少许菌株于装有5ml无菌水的试管中，充分振摇，倒入离心试管中，4000 r / min离心30min,取3支试管，标明BO,B及U（BO：空白管，B：对照管，U：待测管），分别加入0.4g/ml淀粉缓冲液1ml，U管中加入离心所得的上清液100ul，BO管中加入蒸馏水100ul。混匀后放入37℃水浴箱准时水浴7.5min，取出加入碘应用液1ml摇匀，此时B管中加入上清液100ul。各管再加蒸馏水摇匀，660nm的波长下测吸光度。

酶活力计算：    U＝（AB-AU）×80

                    ABO

（5）取突变3min的菌株设30s、1min、3min三个时间梯度（各时间梯度两个平板）再诱变一次，并进行革兰氏染色观察其形态及酶活力测定

四：实验结果

 取突变前后长势较好的菌株配成菌悬液然后用紫外分光光度计测其吸光度结果如下：

取长势最好的菌株为10-3的菌株

突变前：酶活力=80x(AB-AU)/AB0

B0=0.307   B=0.312   U=0.320

则有：酶活力=80(0.312-0.320)/0.307=2.085

第一次突变结果

取长势最好的菌株为紫外光突变5分钟菌株突变第二次，

第二次结果如下

五：实验体会

      本实验是从土壤中分离、纯化出产淀粉酶的芽孢杆菌，并对其酶活力进行测定。通过计算酶活力的大小，我们可以发现酶活力有点偏低，经过讨论，可能的问题是菌种的培养时间太长了、传代的次数太多了，间接影响到了酶活力，使产淀粉酶活力降低。

通过这个实验我们感受良多：其一，实验前小组成员的分工与准备工作安排的不充分造成实验前期比较被动，虽耗费了不少时间，但经过调整实验有条不紊的进行。其二，在分区划线这部分，我们组犯了一定的错误，导致大部分的菌种被污染，整个平板长满了菌，起初我们猜测问题可能出在倒平板培养基时没冷却就倒入平板中造成平板盖上残留大量的水珠，以致造成菌种的大面积的扩散。事后请教其他同学才发觉是我们分区划线时可能是没有做到严格的无菌操作，导致菌种被污染。通过这次的教训让我更意识到无菌操作的重要性。其三，长时间的实验让我们体验到了耐心、恒心、细心的重要，让我们充分认识到做实验时要一丝不苟。如果因为一时的粗心而导致一些细小的错误，就会带来不必要的麻烦，甚至会导致试验的失败，所以我们一定要严格按照试验要求操作。

特别致谢：指导老师徐丽萍，实验室负责老师杨英，队友甘茂良，李春丽，陈程

六：应用与前景

  淀粉酶资源丰富，应用于诸多领域，从最初仅限于医药用消化剂及棉布退浆，到现在的已扩大到食品加工、水果生产、酒精制造、酒类酿造、味精生产、抗生素工业、淀粉加工、洗涤剂生产，生化试剂等方面。

具体应用：

a.在食品中的应用

果葡糖浆的生产：淀粉―→糊精―→葡萄糖―→果葡糖浆，其中运用了耐热性α－淀粉酶、糖化酶和葡萄糖异构酶对淀粉进行分解。

b.从织物上去除淀粉浆剂(脱浆) 

在纺织工业中，淀粉糊可用在经纱上，使织物在纺织的过程中有更好的强度。它还可以防止因摩擦、切断和静电等造成的线损。纺织结束后．应该去除织物上的淀粉，织物经过洗涤、染色才能出厂。织物上的淀粉通常是使用α-淀粉酶来去除的。

c.将淀粉直接发酵生产乙醇

d. 酿酒工业中的应用

e. 淀粉生产废水(SPW)的处理 

食品生产企业的废水中也有淀粉。含淀粉的废水可引起污染问题

f.烘烤食品： 

真菌产生的a一淀粉酶催化淀粉降解成可被酵母利用的糖，面包等食品制作等

g.洗涤剂工业：

餐厅洗碗机的洗涤剂，用于去除难溶的淀粉残迹等

h.其它应用 

淀粉酶，尤其是碱性淀粉酶在各种洗涤剂产品中有着广泛应用。在某种程度上，淀粉酶也被用作消化助剂，补充面粉的糖化活性，改善一些动物饲料的可消化性。

淀粉酶是工业中最重要的酶。如今，在生物制药领域，它也具有重要的作用。虽然淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶，特别是α－淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。应用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用α－淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也应该开发具有有效β－淀粉酶活性的菌株，β－淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。在工业上的作用，淀粉酶的耐热性已成为非常重要的性质，因此，我们也应该努力从耐热和极端耐热的微生物中生产淀粉酶。另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。