核酸检测技术在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用分析

doi: 10.11857/j.issn.1674-5124.2020020031

核酸检测技术在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用分析

韩雨桐， 栾荣生

(四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院，四川 成都 610041)

摘　要: 自新型冠状病毒肺炎爆发以来，疫情迅速蔓延至全国各地区。准确并及时诊断新型冠状病毒感染对患者的治疗以及疫情的防控至关重要。基于实时荧光RT-PCR 技术的病毒核酸检测是新型冠状病毒肺炎诊断的主要手段。该文简要介绍新型冠状病毒核酸检测技术的原理及流程，并从疾病特点、检测试剂盒的性能、临床采样过程、实验操作等方面分析可能影响检测结果准确性的因素，为进一步提高新型冠状病毒核酸检测效能，降低漏诊率提供依据。

关键词: 新型冠状病毒; 新型冠状病毒肺炎; 核酸检测; 诊断中图分类号: R446文献标志码: A

文章编号: 1674–5124(2020)03–0073–04

Analysis of the application of nucleic acid testing in

the diagnosis for novel coronavirus pneumonia

HAN Yutong, LUAN Rongsheng

(West China School of Public Health and West China Fourth Hospital,

Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Abstract : Since the outbreak of the new coronavirus pneumonia , the epidemic has spread rapidly nationwide.Accurate and timely diagnosis of the infection of 2019-nCoV is crucial to the treatment of patients and the prevention and control of the epidemic. The nucleic acid testing of RT-PCR is the main method for the diagnosis of novel coronavirus pneumonia. This paper briefly introduces the principle and process of nucleic acid testing for 2019-nCoV, and analyzes the factors that may affect the accuracy of the detection results in terms of disease characteristics, detection kit performance, clinical sampling, experimental operation, etc., so as to provide bases for effectively improving the detection efficiency, especially reducing rate of missed diagnosis of the nucleic acid testing for 2019-nCoV.

Keywords : 2019-nCoV; novel coronavirus pneumonia; nucleic acid testing; diagnosis

收稿日期: 2020-02-18；收到修改稿日期: 2020-03-10

作者简介: 韩雨桐（1996-），女，黑龙江鹤岗市人，硕士研究生，专业方向为行为流行病学。

第 46 卷 第 3 期中国测试

Vol.46 No.32020 年 3 月

CHINA MEASUREMENT & TEST March, 2020

新型冠状病毒肺炎( COVID-19)，简称“新冠肺炎”，其病原体为新型冠状病毒 (2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)。自2019年12月在湖北省武汉市发现新型冠状病毒肺炎病例以来，该病在我国迅速传播蔓延。2020年1月31日，世界卫生组织宣布新型冠状病毒感染的肺炎疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。截至2020年2月16日，我国累计报告确诊病例70 548例，现有疑似病例7 2例，病死率达2%~3%[1]。依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》，新冠肺炎的诊断需结合流行病学史、临床表现、肺炎影像学特征以及病原学检测结果，其中病毒核酸检测阳性或病毒基因测序和新型冠状病毒高度同源是确诊新冠肺炎的金标准[2]。而比起基因测序，病毒核酸检测简便，快速，且成本相对较低，是目前新冠肺炎确诊最主要的方法。本文就目前病毒核酸检测方法在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用情况进行分析。

1 新型冠状病毒核酸检测原理及流程

新型冠状病毒属于β属冠状病毒，其核酸为非节段单股正链RNA[3]，病毒中特异性RNA序列是最先能被检测到的标志物，可通过逆转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 鉴定。该方法是根据新型冠状病毒核酸基因来设计引物实现靶标检测，其基本原理是以检测样本中提取出来的病毒单链RNA为模板，利用反转录酶在适当的反应条件下，合成互补链cDNA，再引入特异性扩增引物，通过DNA聚合酶大量富集目标DNA片段，在荧光染料或荧光淬灭探针的结合下，每扩增一条特异性的DNA链就会形成一个荧光分子，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[4]。目前从新型冠状病毒感染者体液中分离出的病毒株中，已破译出该病毒全基因组序列，结果提示新型冠状病毒约含3万个碱基，包含12个蛋白编码区/开放读码框(ORF)[5]。新型冠状病毒核酸检测常用的引物和探针主要针对新型冠状病毒基因组中的开放读码框1ab (open reading frame 1ab, ORF1ab)、核壳蛋白 (Nucleocapsid protein, N) 基因和囊膜蛋白 (Envelope protein, E) 基因区域[6]。

新型冠状病毒核酸检测流程包括样本采集、保存、转运、样本前处理、核酸提取、扩增检测核酸以及结果判读等[7]。常规的样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。若要确认一个病例为阳性，需同一份标本中新型冠状病毒至少2个靶标 (ORF1ab/N/E) 的检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性或检测结果落在灰区，则需进行标本复测或换一种试剂再测，仍然可疑则需重新采样再检测，另外阴性结果也需排除可能导致假阴性的因素[6]。检测试剂盒性能如何、采样是否规范有效、实验操作是否标准等各个环节都影响着最终的检测结果。

2 新型冠状病毒核酸检测结果准确性的影

响因素

通过应用实时荧光RT-PCR技术，可以在早期识别患者的感染情况，并且可通过定量检测病毒的拷贝数，动态监测患者的病毒感染程度和治疗效果。随着核酸检测技术在新型冠状病毒确诊中的不断应用，其结果准确性，尤其是“假阴性”导致的漏诊问题逐渐突出。在面对当下突发性新冠肺炎疫情时，如何保证核酸检测结果的准确性，提高检测的敏感性和特异性，尤其是降低漏诊率，对疫情的有效防控具有重要的意义[8]。因此，本文根据目前新型冠状病毒核酸检测技术的应用现状，对可能影响检测结果准确性的主要因素进行探讨，为有效提高核酸检测效能提供依据。

2.1 检测试剂盒的设计与验证

由于新冠肺炎疫情爆发突然并蔓延迅速，国家食品药品监督管理局启动应急审批程序，截至2020年2月1日，已批准了7家公司的7个新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品，用于紧急应对此次疫情。在如此短时间内完成对一种新型病毒核酸检测试剂盒的研发和审批，试剂盒的质量和性能参数设置难免存在不足，如可能存在对试剂优化不充分以及各批次间差异大等问题，影响检测结果的准确性[9]。由于对该病毒的研究仍处于起步阶段，其作为RNA 病毒的一种，稳定性较低，基因变异频率可能较高，目前尚缺乏大样本病毒基因组研究，核酸检测的引物和探针只能根据有限的公开数据来设计，实际应用中可能出现个别样本由于扩增区突变而导致的假阴性[10]。目前，新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能评估和临床验证均有待进一步完善[11]。此外，实验室可对每批试剂盒采用保存的已知几份阴性和阳性样本进行使用前的质检，或使用不同厂家的试剂

74中国测试2020 年 3 月盒对样本进行平行检测比对等，并加强室内质控和室间质控，尽可能减少漏诊和误诊。

2.2 患者症状严重程度

自疫情爆发以来，我们对于新型冠状病毒的认知在逐步增加，但在感染病毒后，患者体液中病毒载量与症状严重程度是否呈线性正相关关系尚不明确。以甲型H1N1病毒感染为例，多项研究均提示患者鼻咽拭子病毒核酸检出率与病毒感染进程及疾病严重程度密切相关[12-13]。由于新型冠状病毒肺炎存在潜伏期感染（具有传播能力）和无（轻）症状感染患者，该类患者的检测样本中病毒拷贝数可能较低，导致核酸提取浓度不够，使仪器检测不到荧光信号，较易出现假阴性的结果。如何及早发现此类患者，降低传播风险，是疫情防控的重点之一。2.3 临床采样误差

临床采样过程中的采样部位和深度、采样时机以及采样操作是否规范等均是决定核酸检测结果准确性的重要因素[8]。研究表明，新型冠状病毒患者下呼吸道的肺泡灌洗液中病毒核酸检出率最高，其次是痰液，再是鼻拭子，咽拭子检出率最低[14-15]。肺泡灌洗液采样难度较大，目前大多用于已使用呼吸机的重症病人或病情进展迅速的患者。另外，最近的一项研究发现，只有小部分(33.4%) 新冠肺炎病例有咳痰症状[16]，痰标本较难得到，因此鼻咽拭子作为最广泛应用的采样方式，核酸检测漏诊率较高。同一采样部位也可能因感染病程的进展而出现病毒载量的差异，根据患者病程阶段选择合适的采样部位，或增加同一患者不同部位的采样均可有效提高检测灵敏度[14,17]。此外，样本的质量与采样操作者有一定关系，采样操作不规范也可导致误差，如采集样本时深度不够，没有采集到足够量含有病毒的细胞，可能造成“假阴性”；因此，临床采样最好是由经过培训且熟悉实验技能的人员来完成。

2.4 样本运输及实验室检测条件

新型冠状病毒是单链RNA病毒，易发生核酸降解或死亡，因此适宜的样本运输和保存条件是确保样本质量的重要因素。另外，临床实验室的标准操作和质量控制措施也是影响检测结果准确性和可靠性的关键因素；因此，检测过程应严格遵循操作规程[18]，加强对实验室人员的培训，不断完善实验室质量管理体系，减少因实验室检测操作不当而出现的漏诊或误诊。3 结束语

实时荧光RT-PCR是新型冠状病毒肺炎确诊最主要的方法，在早期发现、隔离以及治疗新型冠状病毒肺炎患者中均起着重要作用。但是该方法不可避免地会出现结果“假阴性”或“假阳性”的情况，检测试剂盒的质量、患者病程进展、临床采样误差、以及样本运输和实验室检测条件等因素均可能影响核酸检测的灵敏度和特异度，从而影响检测结果的准确性。相信在大数据及信息共享的时代背景下，随着对新型冠状病毒研究的不断深入，对这些影响病毒核酸检测结果准确性的因素进行不断调整改进，将有效提高检测效能，从而及时准确诊断感染者，降低漏诊率，控制疫情的传播[19]。

在应对突如其来的新型冠状病毒肺炎疫情时，目前使用的核酸检测方法存在检测时间较长、操作步骤繁复、假阴性结果较多等问题，在确诊感染患者方面可能具有滞后性。因此，为了达到早期筛查、疑似病例分流、及时隔离与治疗患者的目的，除病原学检测确诊外，可根据临床症状、CT影像等进行辅助诊断。尤其是在新冠肺炎患病率高的湖北省，CT检查可达到较高的阳性预测值，将“疑似病例具有肺炎影像学特征者”作为湖北省临床诊断病例标准，对新型冠状病毒肺炎的有效防控具有重要意义[2,20]。此外，特异性抗体检测可能是未来新型冠状病毒病原学快速检测的有效手段。通常，机体在感染病毒后，IgM抗体在感染早期出现，IgG抗体在感染中晚期出现，并可在血液循环中存在较长时间，因而抗体检测可用于明确近期或既往是否感染过新型冠状病毒，且该方法对采样要求较低，能够有效突破核酸检测技术对人员、场所的，缩短检测用时[21]。新型冠状病毒肺炎诊断方法及诊断标准的不断完善，将极大推动疫情的防控进程，达到全面战胜疫情的目标。

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[21](编辑:莫婕)

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