RNA甲醛变性胶电泳

提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况

一、试剂：

DEPC（Sigma公司产品），MOPs（Bocherigmer公司产品），甲酰胺（Formamide，Sigma公司产品），溴酚蓝（Bromphenol Blue，Sigma公司产品）。EDTA-Na2，氢氧化钠，醋酸钠，甲醛，甘油，分析纯，国产。

RNA甲醛变性胶电泳

二、试剂配制：

1、DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水2L，在通风橱中，加入2ml DEPC到2升去离子水中，终浓度为0.1%的DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15磅灭菌20min。

2、10 × FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA）：配制500ml，称取3.4g NaAC?3H2O放入1000ml烧杯中，加入400ml DEPC 处理过的去离子水，加入搅拌子，放在磁力搅拌器上溶解。然后加入20.9g MOPs，放在磁力搅拌器上溶解。再加1.86g EDTA二水二钠，放在磁力搅拌器上溶解。用1M灭过菌的NaOH 调PH至7.0（约用NaOH 40ml），用DEPC 处理过的去离子水定容至500ml，装入棕色瓶中，写好标签，室温避光保存。

4、5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer）： 配制10ml。预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：

4.0ml 10 × FA buffer

3.1ml 甲酰胺

2.0ml 100%的甘油

720ul 37%的甲醛

80ul0.5M的 EDTA （PH 8.0）

16ul 水饱和的溴酚蓝

100ul DEPC水

混匀，分装，-20℃保存，常用放4℃保存。

5、1×甲醛变性胶电泳缓冲液（1×running buffer）：20 ml 10×FA gel buffer，4.0 ml 37%的甲醛，176 ml水，放入电泳槽中使用，一般在3次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。

6、1.2%的甲醛变性胶：称0.4克琼脂糖，加入3.34 ml 10×FA gel buffer，加入30 ml DEPC水，微波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约50-60℃，再加入600 l甲醛，倒入7.5×5.0 cm的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温放置约30min后即可使用。

RNA甲醛变性胶电泳

三、实验方法

一般取0.3 g的总RNA，加入1/5体积的5×加样缓冲液，65℃加热5 min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在RNA样品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙锭（EtBr，浓度1.0 mg/mL），而不在胶中加EtBr，这样电泳后的背景较低。配好的1.2%的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5-10 V/cm的电压降下电泳30min。图1是我们实验室用以上方法检测酵母总RNA的电泳图。

图1 酵母total RNA的甲醛变性胶电泳。1，酵母total RNA（0.3 g）；2，酵母total RNA（0.5 g）；3，RNA Marker（0.2 g）。RNA的质量判断标准是有清晰的26S，18S条带，无降解，且肉眼观察26S条带亮度约是18S的1-2倍

你这个问题我也遇到过，因为我要做NORTHERN BLOT，所以前几个月一直摸方法。我的方法不和分子科隆上的完全一样，但肯定能得到很好的电泳图（我用手工提RNA）。我开始时跑胶后基本什么都没有，连降解都没看见，应该和你的情况一样吧，呵呵！以下是我的PROTOCOL，你可以试试，我的电泳图就很漂亮，可惜我不会上传图！我觉得你用EB染应该没有问题，但你那方法我没有试过，你可以直接加在胶里啊！至于甲醛只要是新的没有必要去离子化，但是如果甲醛PH低于4的话，那就要处理一下，或换新的。

方法：

1．配制5X甲醛凝胶电泳缓冲液： 

5X甲醛凝胶电泳缓冲液

0.1mol/L MOPS(PH7.0)

40mmol/L 乙酸钠

5mmol/L EDTA(ph8.0)

将20.6g 丙磺酸（MOPS）溶于800ml 经用处理DEPC的50mmol/L的乙酸钠溶液。用2mol /L氢氧化钠将溶液的ph调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5mol/LEDTA（ph8.0），再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液经用0.2umol微孔虑膜过滤除菌，比光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可以正常使用，而深黄色缓冲液则不然。

DEPC有致癌之嫌，须小心操作！

2．制备凝胶：适量琼脂糖溶于1X甲醛电泳缓冲液（Ph6.9～7.0），至终浓度1％。微波炉溶解琼脂糖，然后冷却至50～60℃。将37％甲醛溶液（12.33mol/L）加入凝胶溶液，至终浓度0.32mol/L，加两滴EB（制胶盘约30ml），混匀倒入制胶盘中，插好梳子，让凝胶凝固1h后用。

3．在EP管中，将RNA样品（用高压灭菌水适当稀释）与等体积的加养缓冲液混合，总体机约为加养孔体积的80％。

甲醛凝胶加样缓冲液：

甲酰胺 0.75ml

5x甲醛凝胶加样缓冲液 0.30ml

甲醛 0.24ml

甘油 0.15ml

1.2溴酚蓝 0.05ml

置-20℃保存。

4．将样品置沸水浴2～4分钟，然后置冰上冷却2分钟，使RNA变性，1200r/min离心5秒，使液体全部沉积在EP管底。

5．加样前将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V/cm, 然后将样品加至凝胶加样孔。用已知大小的RNA作为分子量标准参照物，如：18S和28SrRNA

6．将凝胶浸入1X甲醛凝胶电泳缓冲液中，3－4V/cm电压降进行电泳。电泳缓冲液不需进行持续循环，电泳1－2小时后收集并混合两个液槽的缓冲液。

（我配30ml胶大概加甲醛700ul左右，比分子克隆上少得多，但电泳以及转膜的效果都还可以）