MDA等生理指标测定方法

计算：

配药：(1)3%磺基水杨酸溶液: 6g----200ml

      (2)2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/l磷酸经3：2混合，作为溶剂进行配制。

冰乙酸　　            90ml

                               85%磷酸（15mol/l）　　24ml用去离子水定溶至60ml

                               茚三酮　              3.75g

测定：（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎叶片0.5g，分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min.

      (2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液（0号调零管：2ml冰乙酸+3ml显色液+2ml去离子水），于沸水浴中加热40min.

      (3)取出冷却后向各试管加入5ml甲笨充分振荡，以萃取红色物质。静置，待分层后吸取甲笨层，以0号管为对照在波长520nm下比色。

计算: 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量。

　　　Y = ( C * V ) / ( A * W )

式中：C――提取液中脯氨酸含量（由标准曲线求得），ug;

V――提取液总体积，5 ml

A――测定时所吸取的体积，2ml; 

W――样品量，g;

Y――脯氨酸含量（干重或鲜重），ug/g.

SOD,POD,MDA酶和可溶性蛋白质的配药：3个重复，

1 SOD 

   1  pH7.8磷酸缓冲液:

(a)14.4gNa2HPO4·12H2O溶于400mL水中取366mL；

（b）6.24gNaH2PO4·2H2O溶于400mL水中取34mL;两液混成400mL，即为pH7.8磷酸缓冲液。

2  104 mmol/L 蛋氨酸(甲硫氨酸)：称取0.39g蛋氨酸，用蒸馏水定容至25mL容量瓶中

3  300 umol/L  NBT(氮兰四唑)：称取0.0125gNBT，用蒸馏水定容至50mL.

4  0.8mmol/L EDTA：称取0.012mgEDTA，用蒸馏水定容至50mL容量瓶中

5  320uM/L核黄素：称取0.012g核黄素，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中

反应液：                                                         配药用量

pH7.8磷酸缓冲液：                  2ml　　　　　　　　　100ml

　　　　104 mmol/L 蛋氨酸(甲硫氨酸)         0.5ml                 25ml

　　　　　300 umol/L  NBT(氮兰四唑)            1ml                  50ml

　　　　0.8mol/L EDTA：                      0.5ml                 25ml

2  POD 

1  pH7.0的10mmol/L磷酸缓冲液

(a)称取1.56g NaH2PO4·2H2O,定容于1000ml容量瓶中,取390ml.

(b)称取3.5g Na2HPO4·12H2O定容于1000ml容量瓶中。取610ml.混合后即为1000ml pH7.0的磷酸缓冲液.

2  40mmol/LH2O2      0.3ml ------100ml   用蒸馏水配制

3  20mmol/L愈创木酚  0.1ml------50ml    用蒸馏水配制

4  20％三氯乙酸       10g------50ml      用蒸馏水配制

反应液：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配药用量

（1）  磷酸缓冲液 （pH7）           2.91ml            291 ml

 (2)   愈创木酚                      0.05ml            5 ml

 (3)   40mmol/LH2O2                           0.02ml            2 ml

3　MDA

(1)10%三氯乙酸（TCA）  　　　10g------100ml

 (2) 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）　　先加少量的氢氧化钠（1mol/l）溶解，再用10%的三氯乙酸定溶。

　　　　　　　　　　　　　　　　0.6g------5ml------95ml

4  可溶性蛋白质

     考马斯亮蓝G－250：　称0.1g考马斯亮蓝G－250，溶于50ml　90%乙醇中，加85%的磷酸中100ml，最后用蒸馏水定溶至1000ml，贮于棕色瓶中，此溶液常温下可放置一个月。

酶液制备：取洗净的鲜材料0.5g置于冰浴的研钵中，先加2mLpH7.8的磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维为止倒入离心管中，再用3mL（2+1）磷酸缓冲液洗净研钵并入离心管，在10000转离心20分钟，上清液即为SOD、POD粗提液。

1  SOD 测定　　取4mL反应液，加入50uL的酶提取液再加50uL核黄素, 另作6支不加酶液的处理（用缓冲液代替）作为最大光化还原管（0号调零管：pH7.8的磷酸缓冲液），立即置于4000LX的荧光灯（光照培养箱全光照：H1。温度为室温即可）下进行光还原反应，15分钟后，用黑纸遮光，终止反应。并用0号调零管调零点，在560nm波长下比色测定OD值。

按下式计算SOD活性。

                                       (对照OD值－样品OD值)*样品体积

                            SOD 活性=

对照OD值*样品鲜重＊测定时样品用量

2  POD测定　　取3mL反应液，加入20uL的酶提取液于小管中，充分混合后，在34C恒温水浴中反应三分钟。然后加20％三氯乙酸20uL，终止酶活性。以pH7.0的磷酸缓冲液调零点，在470nm波长下测其光密度。

                样品OD

POD的OD值＝    *稀释倍数

                 0.5g

3　MDA测定    取酶液2ml加2ml0.6%的TBA于试管中（0号调零管：2ml+2mlTBA），摇匀后沸水浴中加热15min，冷却后，4000转/分钟，离心10min.取上清液于532、600、450nm处测其OD值，以0号调零管调零。

MDA浓度=6.45*（OD532-OD600）-0.56*OD450（μmol·L－1）

MDA含量=MDA浓度*提取液体积(5ml?)/鲜重（0.5g）（μmol/g FW）

4  可溶性蛋白质测定　　取酶液1ml加5ml考马斯亮蓝G－250于试管中（0号调零管：5ml考马斯亮蓝G－250+1mlpH7.8的磷酸缓冲液），充分混合，放置 15min，.取上清液于于593nm处测其OD值，以5ml考马斯亮蓝G－250+1mlpH7.8的磷酸缓冲液调零。

计算：样品中蛋白质含量（mg/g）=(C*Vt)/(V1*Fw*1000)

C=查标准曲线的蛋白质含量

Vt=提取液总体积(ml)(原始提取液)

Fw=样品鲜重(g)    

V1=测定时加样量（ml）(原始提取液)