中国药科大学现代生化药物复习资料(适用于期末、研究生入学考试)

第一章 PCR

1 PCR的英文全称：Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 

2 PCR是发明者：Kary Mullis 美国科学家 1985申请专利。 Perkin-Elmer Cetus公司第一台PCR扩增仪。

3 PCR的基本原理是什么？  

以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照办保留复制到机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。

A．混合模板DNA，四种核糖的三磷酸盐和DNA聚合酶，加入过量的2种DNA引物，与模板中需要的序列的起始和结束区域结合。

B．加热反应液至94℃以使模板DNA的双链变成单链（变性）

C．冷却至50℃，引物与模板DNA的单链结合（退火）

D．升温至72℃，DNA聚合酶催化DNA复制以产生双螺旋DNA（延伸）

E．重复步骤2-4至满意为止

4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？

一种是与预期长度的片度，一种是比预期长度长的多的产物。

目的产物以指数级数2n增加；另一种产物以几何级数 2n增加，在总产物中所占的比重很小，可以忽略。

5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？

7种：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子、石蜡油

模板DNA：是待扩增序列的核酸,不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、结合DNA的蛋白。

特异性引物：引物是靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。引物是决定PCR扩增片断的长度、位置和结果的关键。引物设计的必要条件：与引物互补的靶DNA序列必须是已知的。

热稳定DNA聚合酶：聚合作用（5’→3’）、 3’→5’的外切酶活力、5’→3’的外切酶活力

脱氧核苷三磷酸（dNTP）：原料。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入降低合成速度，过早终止反应。浓度高于50mmol/L抑制Taq酶的活性，低浓度减少在非靶位置启动和延伸是核苷酸错误掺入。

二价阳离子：影响PCR的特异性和产量，常用的是Mg2+（1.5mmol/L当各种dNTP浓度为200mmol/L时）和Mn2+。

所有热稳定的DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子作为辅助离子。浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。

缓冲液（Tris-Cl,10mmol/L,PH8.3~8.8）：维持PCR反应体系的PH

一价阳离子：标准的PCR缓冲液中包含50mmol/L的KCl，它对于扩增大于500bp长度DNA片段是有益的；提高KCl浓度到70～100mmol/L对扩增较短的DNA片段产物是有益的。

石蜡油：减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。

6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？

A种类：基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增DNA、cDNA和mRNA等几乎所有形式的DNA和RNA都可作为PCR反应的模板。

质量要求：对模板的纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品并不需要另外的纯化步骤，但样品中的有些成分（如菌种保护剂等）会影响PCR反应。

B模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。尽管模板的长度不是PCR扩增的关键因素，但小片段模板的PCR效率要高于大片段分子。除了纯化的DNA外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。

C为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或10^4拷贝的待扩增片段作为起始材料。

7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？

引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的5’末端位置。

特异性引物：引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。

简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。

8 引物设计的基本原则有哪些？

引物设计的必要条件：与引物互补的靶DNA序列必须是已知的。

1、引物长度：引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。

2、（G+C）%含量：在已知扩增片段（G+C）%含量适宜接近待扩增片段，一般以40%～60%为佳。

3、引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发卡结构。

4、引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，否则易形成“引物二聚体”

5、引物3’端配对：其3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确与严格

9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？

（1）Klenow片段 不可耐受95℃的双链DNA的变性温度

（2）Taq DNA酶 可耐受93～95℃的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了PCR特异性、产量和敏感度

『二者的主要区别： Klenow酶的最适温度为37℃，扩增的产物并非全是目的序列，需要探针检测。Taq酶不仅产率高而且特异性也高。它的最适温度为74～75℃。因而使退火温度可以提高，使退火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶量渐感不足而产生平坡。到达平坡的循环次数Klenow酶为20个，Taq酶为30个。延伸片段长度Taq酶为10kb以内；而Klenow酶为400bp以内。』

（3）第二代耐热DNA聚合酶Stoffel片段：半衰期较长

（4）VentNA聚合酶：更加耐热，且具有3’→5’外切酶活性的校正能力。错配率低。

（5）RTth逆转录酶：有很好的依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，二种活性分别依赖于Mn2+、Mg2+，这样就可分别控制酶活性。

10 PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？

4种等浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

每种dNTP的浓度一般在50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L

四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入降低合成速度。过早终止反应。

dNTPs非常容易降解，不要反复冻融。

11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？

影响PCR的特异性和产量

常用的是Mg2+和Mn2+，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用

12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？

变性，通过加热使模板DNA完全变性成单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除；

双链DNA、模板的变性温度有G+C含量来决定，模板DNA的G+C含量较高，溶解温度也较高。变性的时间由模板DNA分子的长度来决定，DNA分子较长，两条链完全分开所需的时间也较长。G+C含量≤55%的线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94-95℃变性45s。

退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；退火是使引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。

复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低。复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的DNA片段的扩增。

退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低3～5℃的条件下进行。

延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。

在热稳定DNA聚合酶催化DNA合成的最适温度下进行。

循环数：PCR扩增所需是循环数取决于反应体系中起始点模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。

13 什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？

反应平台即扩增平台，所谓平台就是PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦的曲线。

原因：引物和dNTP等消耗完毕Taq酶失活与底物过剩，非特异性扩增产物的竞争退火时产物的单链自己缔合、变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用等

14 提高PCR反应的特异性一般可以使用哪几种方法？

（1）引物设计：长度、碱基配对的严格与否、GC含量、退火温度、浓度、纯度、稳定性。

（2）使用热启动：模板变性之后再加入DNA聚合酶（或DNA聚合酶才具有活性）的方法，可以提高反应的特异性

（3）镁离子浓度：较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。

（4）促进PCR的添加剂

（5）使用巢式PCR

15 常用的促进PCR特异性的试剂：单酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱以及PCR×Enhancer Solusion

它们可能的机理是降低溶解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

16 热启动：在PCR反应后，模板变性之后再加入DNA聚合酶（或DNA聚合酶才具有活性）的方法。

17 RACE的全称：Rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端的快速扩增。

18定量PCR:利用PCR反应来测量样品中的DNA或RNA的原始模板拷贝数量。

19 为什么PCR中对产物进行终点检定量不准确？

理论上PCR是一个指数增加的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR效率越来越低，产物扩增的速度就逐渐缓慢。当所有的Taq酶饱和以后，PCR就进入了平台期。即使是重复试验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。

由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何确定的?

Ct值的含义是：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省没置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。试验操作中，Ct值定义为极限上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射所对应的PCR循环次数。“基线上方”也就是阈值高度的量化，定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是Ct值。Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，反之。正常：18～30。Ct值取决于阈值。

21 简述Taqman探针技术的原理。

Taqman探针法是高度特异性的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的5’→3’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发出的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

根据其3，端标记的荧光猝灭基团的不同分为：普通的Taqman探针和TaqmanMGB探针

22 解释下列各种PCR的基本原理： (1) RT-PCR  (2) 多重PCR  (3) 3'-RACE (4) 简并PCR  (5) 不对称PCR       (6) 竞争性PCR  (7)巢式PCR   (8) 降落PCR(touch-down PCR)

(1) RT-PCR 

高浓度的异硫氰酸胍能迅速溶解Pr，使组织和细胞破裂，并使核糖核酶快速失活，酚-氯仿抽提和离心可去除提取物中的蛋白质和DNA，由此得到的上清液经异丙醇沉淀，即可得到细胞总的RNA

(2) 多重PCR  

反转录过程与常规RT-PCR相似，只是前者一般以oligo（dT）引物或随机六聚寡核苷酸引物进行反转录，而不是基因特异性引物进行反转录，这样便于用同一反转录的cDNA扩增多个基因表达产物。多重RT-PCR的PCR过程也与常规RT-PCR相似，只是前者需设计多对基因特异引物用以扩增多个基因的表达产物。

(3) 3'-RACE 

用于mRNA已知序列下游（即3’端）未知序列的扩增

反转录获得3’末端第一链cDNA序列

第一链cDNA片段3’末端的扩增

（仅是很简略，具体见讲义）

(4) 简并PCR  

用多个不同核苷酸序列组成的混合引物库，其基本原理是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库，从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因。简并引物库是由一组引物构成的，这些引物有很多相同碱基，在序列的好几个位置也有很多不同的碱基。

(5) 不对称PCR

产生单链的DNA用于DNA的序列测定，这就是不对称PCR，它指的是利用不等量的一对引物来产生大量的单链DNA（ssDNA）的方法。

(6) 竞争性PCR

与定量PCR有一定的关联和重叠，是后者方法的进一步完善。

通常Q-PCR首先在逆转录酶作用下将mRNA转变为cDNA，然后再对cDNA进行扩增中加入已知浓度的竞争性参考模板，二种模板在同一试管可以竞争同一对引物，两者的产物由于大小不同或酶切位点的不同可以区分开来，并通过对两者扩增产物在凝胶电泳上电泳条带的测量而对mRNA的初始浓度进行定量。

(7)巢式PCR

巢式PCR是一种PCR改良模式，它由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，首先对靶DNA进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增，第二次PCR引物与第一次反应的序列互补，第二次PCR扩增的产物即为目的产物

(8) 降落PCR(touch-down PCR)

 每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，直至达到一个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。主要用于避免非特异性PCR产物的出现。

第2章 放射性同位素知识和应用

1 “核衰变”:放射性同位素的原子核很不稳定，会不间断地、自发地放射出射线，直至变成另一种稳定同位素，这就是所谓“核衰变”。

2 什么叫半衰期？特点是什么？

半衰期（half-life）：即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一半时所需要的时间。

特点：半衰期越长，说明衰变得越慢，半衰期越短，说明衰变得越快。半衰期是放射性同位素的一特征常数，不同的放射性同位素有不同的半衰期，衰变的时候放射出射线的种类和数量也不同。

3 分子生物学实验室常用的几种放射性同位素有哪几种？他们的半衰期分别是多少？

3H、14C、131I、32P、35S，其中半衰期最长为14C，最短为131I

4放射源：放射源是指用放射性物质制成的能产生辐射照射到物质或实体。

5 什么叫同位素示踪法？有什么优点？

同位素示踪法（isotopic tracer method）是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。

优点：灵敏度高方法简便定位定量准确符合生理条件

6 同位素示踪法中使用的同位素是哪种同位素?

7同位素效应：指放射性同位素（或是稳定性同位素）与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别，对于轻元素而言，同位素效应比较严重。

8 举例说明同位素示踪法在分子生物学核生物化学中的应用。

物质代谢的研究、物质转化的研究、动态平衡的研究、生物样品中微量物质的分析、最近邻序列分析法

9 放射性测量的原理是什么？探测仪可以分为哪2类？

原理：放射性同位素发出的射线与物质相互作用，会直接或间接地产生电离和激发等效应，利用这些效应，可以探测放射性的存在、放射性同位素的性质和强度。

一般将探测仪分为两大类：一是“径迹型”探测器；二是“信号型”探测器。

10 闪烁计数器的工作原理是什么？

闪烁型探测器由闪烁体，光电倍增管，电源和放大器--分析器—定标器系统组成，现代闪烁探测器往往配备有计算机系统来处理测量结果。当射线通过闪烁体时，闪烁体被射线电离、激发，并发出一定波长的光，这些光子射到光电倍增管的光阴极上发生光电效应而释放出电子，电子流经电倍增管多级阴极线路逐级放大后或为电脉冲，输出电子线路部分，而后由定标器记录下来。光阴极产生的电子数量与照射到它们上面的光子数量呈正比例，即放射性同位素的量越多，在闪烁体上引起闪光次数就越多，从而仪器记录的脉冲次数就越多。

11闪烁体：闪烁体是一类能吸收能量，并能在大约一微秒或更短时间内把所吸收的一部分能量以光的形式再发射出来的物质。

12 液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器分别适合检测什么样的放射性线？

液体闪烁计数器是α射线和β低能射线的首选测量仪器

晶体闪烁计数器适合检测γ射线

13 人体各种器官中，对辐射最为敏感的是什么器官?

造血器官、胃肠道（小肠最敏感，胃和结肠次之）

14 什么叫细胞的间期死亡？增殖死亡？

间期死亡（intermitotic death）：细胞受照射后不经，在几小时内就开始死亡，称间期死亡，又称即刻死亡。

增值死亡（reproductive death）：细胞受照射后经过1个或几个周期以后，丧失了继续增值的能力而死亡，称增值死亡或延迟死亡。

15 什么叫外照射？内照射？辐射的确定性效应？随机效应？

外照射：辐射源由体外照射人体称外照射。

内照射：放射物质通过各种途径进入机体，以其辐射能产生生物学效应者称内照射。

辐射的确定性效应：亦称非随机性效应，指效应的严重程度（不是发生率）与照射剂量的大小有关，效应的严重程度取决于细胞群受损细胞的数量或百分率，存在阈剂量。

随机效应：指效应的发生率（不是严重程度）与照射剂量的大小有关，这种效应在个别细胞损伤（主要是突变）时即出现，不存在阈剂量。

16 放射防护的3原则是：放射实践的正当化放射防护的最优化个人剂量

17 外照射防护的基本措施是：时间防护、距离防护、屏蔽防护

18 放射性的“三废”是指：放射性废气、废液和固态废物

19 外照射的α，β和伽马射线应该分别如何防护？

α粒子穿透能力弱，不会引起外照射损伤，纸；β辐射常采用低原子序列的铝或有机玻璃；X、γ射线常采用高原子序列的铅、铁或经济适用的混凝土等材料；

20 医院中使用的X光机中有没有辐射源？为什么？

没有。

高速电子轰击靶物质时，会产生X射线。X光机的核心部分是X线管，通常由安装在真空玻璃壳内的阴极和阳极组成。阴极为钨丝，阳极则根据不同需要由不同材料制成多种形状。也就是说，X光机里没有“密封源”

第3章 分子杂交技术

1 核酸分子杂交的分子基础是什么？

核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这就是核酸分子杂交的基础。

2 举例说明哪些生物反应是属于探针－靶反应？

a．抗原-抗体b.外源凝集素-碳水化合物c.亲和素-生物素d.受体-配基e.互补核酸间的杂交

3 核酸探针的种类有哪些？各有什么特点？

A基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类。

B根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针及寡核苷酸探针等几类。

C DNA探针还有单链和双链之分

各自特点：

DNA探针：最常用的核酸探针；主要特点有：这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便DNA探针不易降解。一般可有效抑制DNA酶活性DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择。

cDNA探针：互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶催化产生的不含有内含子序列，尤其适合于基本表达的检测。

RNA探针：主要用于研究目的，而不是用于检测。高杂交效率，但RNA探针也易降解、标记方法复杂。

寡核酸探针：链短、序列复杂度低、分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基对变化一次可大量合成寡核苷酸探针，价格低廉，可用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记

4 探针标记技术可以分为哪两类？  非放射性标记技术和放射性同位素标记技术

5 核酸探针常用的酶促标记技术有哪几种？

缺口平移、DNA快速末端标记、用T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端、随机引物延伸、聚合酶链式反应

6 缺口平移标记技术的原理是什么？利用了什么酶的哪些？

原理：首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口，缺口处会形成3’-羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。若用高强度的放射性核苷酸（[α-32 P]dATP）,即得到被标记的DNA探针。

酶：DNA聚合酶Ⅰ的核酸外切酶活性，核酸外切酶水解核苷酸的活性。

7 DNA快速末端标记中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？

DNA快速末端标记中使用的酶：Klenow片段

DNA快速末端标记中使用的同位素：[α-32 P]dNTP

8 标记DNA 5'末端时使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？与DNA快速末端标记中使用的有什么不同？

标记DNA 5'末端时使用的酶：T4多核苷酸激酶（PNK）

使用的同位素是[γ-32 P]dNTP

DNA快速末端标记中使用的同位素是[α-32 P]dNTP

9 核酸的非放射性标记技术可以分哪几类？

两大类非放射性标记核酸技术：酶促反应标记法和化学修饰标记法

10 常用的非放射性标记系统中，有哪几种常用的非放射性物质可用来标记核酸分子？P116

a生物素 b异羟基洋地黄甙 c光敏2，4-二硝基苯（PNP）等

11 Southern杂交的过程一般分为哪几步骤？

将DNA标本用性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至

纤维滤膜上，烘干固定后即可用与杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带动位置，从而确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

①DNA标本酶切（性内切酶）

②琼脂糖凝胶电泳分离

③DNA碱变性，Tris缓冲液中和

④高盐下通过毛吸作用将DNA转印到纤维素滤膜上，烘干固定

⑤附于膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带动位置

12 预杂交的作用是什么？

A、防止非特异性杂交，B、封闭试剂

13 核酸分子杂交实验的优化一般可以从哪几个方面考虑？

探针的选择探针的标记方法探针的浓度杂交率杂交最适温度（高温60～58℃特异性高；低温50～55℃特异性低）杂交的严格性杂交的反应时间杂交促进剂

第4章 cDNA文库

1 什么叫基因组文库？cDNA文库？有什么区别？

基因组文库(genomic DNA library)：指将基因组DNA通过性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA所有的序列。

cDNA文库（cDNA library)：指只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的所有的基因序列。

区别：

1重组DNA片段来源不同

基因组文库：来源于某特定生物个体的基因组DNA

ｃDNA文库：来源于细胞中表达出的ｍRNA

②使用范围不同

基因组文库：开展人类基因组计划研究，构建物理图谱等

ｃDNA文库：某特定细胞中基因组表达状态及表达基因的功能

2 构建一个理想的cDNA文库需要考虑的因素有哪些？

a．cDNA文库的质量

（1）文库的代表性：是指文库中包含的重组cDNA分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即mRNA种类），是体现文库质量的最重要指标。

（2）重组cDNA片段的序列完整性：5’端非翻译区，中间的编码序列和3’端非翻译区

b．文库筛选可选择的具体方法

最理想的情况是对于具体构建出的一个cDNA文库，应能够使用多种筛选方法，有效地分离鉴定出目的基因，从而使研究者能够在已有研究条件上，在文库筛选的具体方法上有灵活的选择余地。

3 如何考察确定一个cDNA文库的质量？

（1）文库的代表性：是指文库中包含的重组cDNA分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即mRNA种类），是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用一个量化的指标来衡量，即文库的库容量，它是指构建出的原始cDNA文库中所包含的的重组子克隆数。

（2）重组cDNA片段的序列完整性：在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体的序列不同，但基本上由三个部分组成，即5’端非翻译区，中间的编码序列和3’端非翻译区

4 文库的代表性：是指文库中包含的重组cDNA分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即mRNA种类），是体现文库质量的最重要指标。

5 什么叫文库的库容量？有什么意义？

文库的库容量：它是指构建出的原始cDNA文库中所包含的的重组子克隆数。

具备完好代表性的cDNA文库需要满足的库容量取决于来源细胞中表达出的基因序列中的总复杂度。

6 常用来构建文库使用的载体系统有哪些？各有什么特点？

⑴λ噬菌体载体系统：构建的库容量最大，感染效率最高

缺点：采用的文库筛选方法有限，文库中许多的cDNA片段在宿主细胞中常常无法获得功能性表达

⑵质粒载体系统：体外操作方便，在载体本身的设计上有很大的可塑性，可对cDNA文库进行功能性筛选

缺点，插入片段的载体容量小，因此文库中含有全长cDNA的克隆比例少；文库的库容量较小，质粒文库需要以活的转化菌形式保存和扩增，保存条件严格。

⑶噬菌体载体系统：缺点同“质粒载体”，cDNA文库功能筛选的重要方法

⑷哺乳类细胞表达载体：侵染的细胞增广；对细胞侵染率高；转染进宿主细胞的重组病毒基因能高频地整合到宿主细胞基因组中。

7 构建cDNA文库的基本步骤有哪些？

制备mRNA样品、合成cDNA的第一链、双链cDNA的转换合成、cDNA克隆

8 对cDNA文库进行筛选的策略有哪两种？

一种策略是，以一个已知的分子作为靶标，通过检测在特定条件下文库中与靶标发生相互作用的基因序列或其编码的表达产物，从而分离出目的基因。

另一种测率是，不需要附加任何先决条件，通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间发生相互作用的情况，从而确定出这两个文库中所有可能在生理上发生相互作用的基因对，描绘出某一特定类型细胞内表达出的基因之间发生的基因相互作用的联络图。

9 使用核酸杂交方法筛选cDNA文库时使用的探针有哪几种？

同源探针、简并性寡核苷酸探针、cDNA探针

10 对表达文库进行高通量的功能性筛选有哪几种方法？

噬菌体表面展示系统、酵母双杂交系统、酵母单杂交系统

11 噬菌体表面展示技术的原理是什么？

利用噬菌体表面展示技术克隆目的cDNA基因，是通过体外富集策略进行cDNA文库筛选的一种具体方法。利用大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体（fd或M13）作为载体，在重组噬菌体颗粒表面展示外源多肽分子的分子展示技术。

是通过外源蛋白在宿主大肠杆菌分泌性表达中与丝状噬菌体外膜结构蛋白（如主要外膜蛋白P8和次要外膜蛋白P3）形成牢靠的复合物而得以实现的。

12 酵母双杂交系统的原理和主要功能是什么？一般由哪几部分组成？

原理：GAL4分子（酵母细胞转录因子）上的这种结构功能特征，预示着转录因子上的这两个功能结构域具有可分离性，即可以用一种转录因子的DNA-BD与另一转录因子的AD组合形成一种新的转录因子。

一种蛋白与GAL4的DNA-BD结构域融合，另一种蛋白质则与GAL4的AD结构域融合。将这两个融合蛋白的编码质粒导入同一个GAL4缺失的酵母细胞中，通过相互作用蛋白结合形成复合物，就可重建GAL4活性，转录激活相应的效应基因。

功能：用来分离文库中编码能力与某种特定蛋白质（转称为靶蛋白或诱饵蛋白）发生相互作用的蛋白产物基因。

组成：①编码靶蛋白与DNA结合域融合蛋白的表达质粒。这种靶蛋白在双杂交系统中专称为诱饵蛋白；②cDNA质粒表达文库，文库cDNA表达出的蛋白与转录激活域形成融合蛋白，这些蛋白统称为猎物蛋白；③能反映出体内转录因子活性重建的宿主酵母菌及体现出这种活性的报道基因系统。

13 酵母双杂交体系常常出现假的阳性结果，应该如何正确判读得到的结论呢？

文库中一些cDNA编码蛋白能与报道基因序列结合，也会产生假阳性。这种由系统检测误差产生的假阳性结果，可通过使用不同报道基因系统的双杂交实验进行重复，或检测诱饵蛋白与猎物蛋白在体外相互作用情况，如免疫共沉淀等，来加以甄别。

①使用不同的报道基因系统来重复筛选

②通过在体外检测诱饵蛋白与猎物蛋白在体外的相互作用，如免疫共沉淀

③基于生物学知识判断两蛋白是否会在生物

④查询前人是使用酵母双杂交系统时总结的经验

14 酵母单杂交系统的原理和主要功能是什么？

工作原理与双杂交系统一样，也是利用了真核转录因子的DNA-BD和AD两个功能结构域的可分离性。

功能：是cDNA文库筛选的另一种方法，主要用于从cDNA文库中筛选出与特定DNA序列结合的蛋白基因，如转录因子等基因表达因子，是目前分离这些蛋白基因最有效和可靠的方法。

第6章 大肠杆菌表达系统

1 使用大肠杆菌表达系统表达外源基因有哪些优点？

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。

2 质粒表达载体一般包括哪些主要的组成部分？

复制子、筛选标记、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件

3 质粒表达载体中一般在什么位置使用终止子？

1、位于启动子的上游，此终止子可以防止由质粒上其他基因启动子产生的通读作用，以降低诱导前的本底表达。

2、位于启动子的下游，此终止子可以控制目的基因mRNA的长度，提高其稳定性，又能避免质粒上其他基因的异常表达导致高拷贝质粒的稳定性下降的缺陷。

4 使用简明的语言叙述Lac/Tac表达系统、PL和PR表达系统以及T7表达系统的主要特点。

1、Lac/Tac表达系统主要特点：

Lac系统以大肠杆菌lac操纵子机理为基础设计构建的表达系统，该操纵子的转录受正调节因子AP和负调节因子lacⅠ。LacUV5只受lacⅠ。用tac启动子代替LacUV5启动子构建Tac表达系统。

无诱导物情况下，LacUV5，tac启动子有较高的本底转录。

2、PL和PR表达系统主要特点：

已λ噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的。PL、PR启动子具有很强的启动转录能。野生型λ噬菌体——转录与否决定了λ噬菌体进入裂解循环还是溶解循环。都是选用温度敏感突变株的基因产物来PL、PR启动子的转录。带有PL、PR启动子的表达载体在大肠杆菌中相当不稳定。由于PL和PR表达系统在诱导这一环节上不加入化学诱导剂，成本又低廉。

A．首先是在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。

B．其次是在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白的表达量有一定的影响。

T7表达系统主要特点：

完全依赖于T7 RNA聚合酶，T7噬菌体启动子的转录，除由噬菌体提供，也可由转化质粒提供。

5 使用大肠杆菌表达外源基因时，产生的蛋白质在大肠杆菌体内有哪几种形式？各有什么特点？

目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种，一是在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒；二是在细胞内表现为可溶性的蛋白质。

形成包涵体：

优点：1）有毒、致死的目标蛋白质能够表达； 2）有利于目标蛋白质的富集和分离纯化，防止被蛋白酶水解

缺点：1）变性→复性，经过复性处理的目标蛋白质不一定具有活性；2）成本高

可溶性蛋白质的表达：避免复性带来的缺点，但不能正确折叠

6 使用大肠杆菌表达外源基因时，产生的蛋白质在大肠杆菌体中的位置有哪几种？各有什么特点？

不溶性的包涵体颗粒——细胞质中

可溶性的蛋白质——细胞质、周知空间、营养液中

●在细胞质中表达，有如下优点：

1）表达质粒构建简单

2）达到很高的目标蛋白质表达量

3）没有编码成熟蛋白质的ATG（附加的甲硫氨酸）

●在周质空间表达：

1）数量少，蛋白质水解的含量也很少，有利于蛋白质的纯化

2）信号肽被切除，有效避免了N端甲硫氨酸的产生

3）利于折叠，维持正确构象

●在营养液中表达：分泌型蛋白质 最佳状态

7 如何在大肠杆菌中高效表达外源基因？可以从哪几个方面考虑？

①表达质粒的优化设计

②共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因

③提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性

④高密度发酵和工程化宿主细胞

8 谈谈大肠杆菌表达系统的发展趋势

系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中海存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。

需要研究的主要为问题有：如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大肠杆菌内有较高的活力和专一性；如何通过基因工程技术改造真核生物的糖基化多酶体系使其能整合到大肠杆菌的染色体中和对糖基化位置和糖基种类和长度进行控制等等。关于表达产物的构象，分泌，定位和修饰加工研究室今后大肠杆菌表达系统研究的重点方向。